昆虫miRNA研究进展

杨 婕, 谢 苗, 徐雪娇, 白建林, 尤民生,*

(1. 福建农林大学, 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室, 福州350002; 2. 福建农林大学应用生态研究所, 福州350002;3. 福建农林大学, 教育部害虫生态防控国际合作联合实验室, 福州350002; 4. 福建农林大学生命科学学院, 福州350002)

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类内源性的长度约为19～24 nt的单链非编码小RNA，广泛分布于动物、植物以及微生物体内，在基因的转录后调控(post-transcriptional regulation)中起着至关重要的作用，参与调控胚胎发育、细胞分化、增殖、神经发生、能量代谢、细胞凋亡以及昼夜节律等多种生物进程(Legeaietal., 2010)。据估计，动物中约有50%以上编码蛋白的基因的表达都受到miRNA的调控(Kroletal., 2010)。

Lee等(1993)在秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans幼虫中发现了第一个由lin-4基因编码产生的短链RNA，该短链RNA与lin-14基因3′UTR区存在的多个重复序列反向互补，因而能够通过负链RNA-RNA互作时序性抑制lin-14基因的蛋白合成。Reinhart等(2000)在秀丽隐杆线虫中发现了另一种具有时序调节功能的基因，将其命名为let-7。这类参与时序调节的RNA片段一般长度较短，且参与调控细胞发育进程，也被称作小时序RNA(small temporal RNA, stRNA)，stRNA的发现掀起了对非编码小RNA的鉴定以及对其生物学功能进行研究的热潮。2001年，美国和德国的3个实验室同时在《Science》报道了几十个来自秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster以及人类Homosapiens的小RNA，由于这些基因具有相似的加工过程、结构、生理功能以及作用机制，科学家将这一类RNA统一命名为microRNA(miRNA)，这也是对昆虫miRNA最早的报道。

继miRNA被发现后，其在昆虫中的研究工作逐渐开始发展，在Web of Science上以“microRNA insect”或“miRNA insect”为关键词进行搜索，可以发现在21世纪相关报道逐渐增多，迄今为止已超过1 200篇，内容涉及miRNA及其靶标的鉴定、昆虫抗药性、抗病毒机制、免疫机制、昆虫行为和其生长发育等多个方面，相关引文数量也不断增加。随着miRNA相关研究的不断深入，其鉴定方法和技术也得到了大幅改进，研究人员相继在许多物种中鉴定得到了大量已知和新的miRNA，为后续miRNA的相关研究建立了坚实的工作基础。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的生物合成

miRNA的生物合成过程较为复杂，动物中成熟miRNA的合成过程主要包括4个步骤：转录、细胞核内加工、细胞核输出以及细胞质加工。首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II)的催化作用下，转录生成长度可达1 kb以上的双链miRNA前体，即miRNA初始转录物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA可自发形成发夹结构(Cullen, 2004; Leeetal., 2004)。随后，Pri-miRNA在细胞核内被RNase Ⅲ家族的双链RNA结合蛋白Pasha(哺乳动物和线虫中称为DGCR8)特异识别，并被其与Drosha内切酶所形成的复合物剪切成为长度约为70～100 nt的miRNA前体(Pre-miRNA)，同时在其3′末端产生2个未配对的核苷酸。核内转运蛋白Exportin-5可以特异识别并紧密结合Pre-miRNA 3′端突出的2个未配对核苷酸，将其从细胞核运送至细胞质中。Pre-miRNA在细胞质中被释放出来并进一步被Dicer酶剪切成为miRNA-miRNA*双链分子(Kettingetal., 2001; Knight and Bass, 2011)，即未成熟的miRNA(imperfect miRNA)。miRNA-miRNA*双链分子再与以Argonaute 1(AGO1)为核心的蛋白质复合体相结合，双链分子打开成为两条单链的miRNA，其中一条链即为成熟的miRNA，称为向导链(guide strand)，向导链参与形成miRNA诱导的沉默复合物(miRNA-induced silencing complex, miRISC)，遵循碱基互补配对原则与靶基因结合，调控基因表达(Bartel, 2004)，另一条miRNA*即为随从链(passenger strand)(图1: A)。由于没有相应蛋白质的保护，miRNA*容易被迅速降解，因而其丰度远低于miRNA(Lagos-QuiIltanaetal., 2002)。但是目前随着miRNA相关研究的不断深入，有一些证据表明，miRNA*也可与AGO蛋白结合从而调控相关基因的表达(Förstemannetal., 2007; Tomarietal., 2007; Okamuraetal., 2009)，也可能会转变成为新的miRNA或有功能的miRNA产物(Okamuraetal., 2008)。

1.2 miRNA的作用方式

目前，对小鼠Musmusculus、秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇和拟南芥Arabidopsisthaliana等模式生物中的miRNA及其调控机制的研究工作已取得一定进展(Babiarzetal., 2008; Enderetal., 2008; Ravasietal., 2010)。

成熟miRNA的5′端第2-8位核苷酸被称为miRNA的“种子序列(seed sequence)”，通常能与靶基因mRNA的3′UTR区以碱基互补配对原则进行结合从而调控基因表达(Leeetal., 1993; Wightmanetal., 1993)。除此之外，miRNA也可以作用于靶基因ORF以及5′UTR(Orometal., 2008)。已有研究表明，超半数的AGO蛋白与miRNA的结合位点位于ORF区内(Chietal., 2009; Greyetal., 2010; Hafneretal., 2010)。在ORF区和3′UTR区均含有靶位点的基因的mRNA和蛋白的表达水平略低于仅在3′UTR有靶标位点的基因，同时其表达也会受到更多调控(Fang and Rajewsky, 2011)。miRNA一般通过两种机制负向调控靶基因的表达：在植物中，miRNA通过与靶基因完全互补导致靶基因mRNA被切割或翻译抑制；在动物中，miRNA则通过与靶基因不完全互补抑制靶基因的翻译，即翻译起始后抑制蛋白形成。例如果蝇中某些miRNA的结合位点位于ORF区和5′UTR区，miR-2通过cap-dependent的方式抑制靶标mRNA翻译起始，并且在ORF和5′UTR的结合位点诱导其去腺苷酸化，进而调控基因表达，影响胚胎发育过程中的细胞凋亡(Ronaldetal., 2003; Leamanetal., 2005)。

miRNA和靶基因的关系并不是一一对应的，而是“多对多”的关系，即一个miRNA可以调控多个靶基因的表达，一个靶基因也可能受到多个miRNA的共同调控(图1: B)。各种miRNA和靶基因构成了一个庞大的基因调控网络，而这种机制的存在也使得miRNA调控基因表达的过程十分复杂(Brodersen and Voinnet, 2009; Shinetal., 2010)。

1.3 miRNA的研究方法

图1 miRNA生物合成过程(A)及miRNA介导的基因调控机制(B)

1.3.1miRNA及其靶标基因的鉴定：miRNA的鉴定主要有3种方法：直接克隆法、生物信息学预测以及高通量测序法。其中生物信息学预测目前应用范围较广，利用miRNA前体具有典型的茎环结构和miRNA结构的热力学稳定性等固有特征，利用相关软件对miRNA进行预测(Mendesetal., 2009)。高通量测序可直接从分子水平对细胞或组织中的miRNA进行深度测序并对结果进行分析，无需参考基因组序列，由于其具有灵敏度高、测序通量大且成本较低等优点，被广泛应用于各个物种中(Schreiberetal., 2011)。第二代测序技术主要包括：Roche/454焦磷酸测序、Illumina/Solexa聚合酶合成测序及ABI/SOLID连接酶测序，由于这3种二代测序技术的原理各不相同，其数据产出量、数据质量和单次运行成本也不同。其中Roche/454测序技术序列读长(reads)较长(600～1 000 bp)，但通量较低；Illumina/Solexa测序技术reads较短(约100 bp)但测序通量大，适合进行miRNA测序(RNA-seq)，此外，该测序技术产生的原始数据格式可以应用于多种miRNA分析软件，不仅可以对sRNA的基因组信息进行注释，还可以进行表达水平分析和靶基因预测等；而ABI/SOLID读长最短，只有50 bp，且应用了双碱基编码，有效降低了测序的错误率，尤其适用于具有高质量参考基因组的物种的重测序(Luoetal., 2012)。

相较于植物miRNA与其靶标基因的高度互补，在动物中，miRNA与其靶标基因常形成不完全互补的功能双链，结合区域常会出现gaps和碱基错配(Brenneckeetal., 2005)，这为动物miRNA靶标基因的鉴定带来较大的不确定性。目前常用的miRNA靶标基因预测软件虽算法不尽相同，但都遵循以下几个原则：(1) miRNA与靶位点在种子区域互补；(2) miRNA靶位点在不同物种间较为保守；(3) miRNA与靶mRNA双链间热力学稳定性较高且miRNA靶位点处不存在复杂二级结构；(4) miRNA 5′端的结合能力较3′端强。目前几种常见的靶标基因预测软件主要包括：miRanda(http:∥www.miranda.org/), RNAhybrid(https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/), TargetScan(http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和PicTar(https:∥pictar.mdc-berlin.de/)等。miRanda作为最早的miRNA靶标基因预测软件，主要以序列匹配度、miRNA-mRNA双链热稳定性和靶标位点保守性为筛选依据，允许G=U错配，同时强调miRNA第2-4位碱基与靶标基因的精确匹配(Quilletetal., 2019)。RNAhybrid是经典的RNA二级结构预测软件的扩展，通过分析短链RNA和长链RNA杂交的最小自由能寻找miRNA的最佳靶位点，该算法不考虑靶标基因在物种间的保守性(Rehmsmeieretal., 2004)。TargetScan要求miRNA的种子区域和靶标基因ORF或者3′UTR区完全互补，以此对miRNA生物靶点进行预测，预测假阳性率较低(Agarwaletal., 2015)。PicTar强调miRNA种子区域在靶位点识别以及转录后调控的关键作用，把种子区域分为“完全匹配”和“不完全匹配”，并对两类种子序列对应的miRNA和靶标基因二聚体间的结合能进行限制，有效降低预测假阳性(Xuetal., 2014)。由于各个预测软件算法不同，预测结果也不尽相同，实验中还需采用多个软件分别进行预测后取交集以提高预测准确性。

1.3.2miRNA表达水平检测：miRNA表达水平的检测方法主要有miRNA基因芯片分析、Northern blot分析以及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测。其中基因芯片主要应用于初步检测miRNA表达模式，但其检测结果可能存在一定的假阳性，后续可采用精确度较高的Northern blot以及RT-qPCR等方法进一步验证。Northern blot可以检测miRNA含量以及miRNA分子量大小，但是灵敏度较低(Valoczietal., 2004)。 由于成熟miRNA的长度仅为19～23 nt，必须要在反转录时延长miRNA序列才可以进行PCR扩增，常用的方法有茎环法和加尾法(表1)。茎环法使用特异茎环引物进行反转录，特异茎环引物包括一段通用茎环序列和一段与成熟miRNA 3′端反向互补的6～8个碱基，得到cDNA后用特异上游引物和通用下游引物进行PCR反应，引物既可用于PCR也可用于RT-qPCR；加尾法是在miRNA 3′端加一段Poly(A)尾，然后用带有Poly(T)和一段接头(adapter)引物进行反转录，随后用特异性上游引物和试剂盒带有的通用下游引物进行RT-qPCR扩增。

表1 茎环法与加尾法比较

1.3.3miRNA研究方法：miRNA的研究方法包括对miRNA进行抑制和过表达。抑制miRNA的表达有多种方法，在基因水平上包括：(1)利用CRISPR/Cas9等基因编辑工具将miRNA生物合成途径中起重要作用的Dicer或AGO进行敲除，这将导致个体中所有成熟miRNA的缺失。Kettles等(2013)利用Dicer1和AGO1的缺失突变体拟南芥饲养桃蚜Myzuspersicae，结果显示桃蚜在在突变寄主植物上产卵数较对照组明显减少，表明miRNA能够参与拟南芥与桃蚜的互作，但这无法确定具体是哪个miRNA参与了调控作用。(2)对miRNA调控位点进行突变，从而抑制miRNA与靶基因的结合。但由于miRNA和靶基因间并非“一对一”的调控关系，敲除单个miRNA后，其功能很可能从其他途径得到补偿。在非基因水平上抑制miRNA，目前较常用的是体外合成的miRNA抑制剂(inhibitor)或拮抗剂(antagomir)。antagomir是在inhibitor的基础上，经过化学修饰的人工合成产品。与inhibitor相比，antagomir在动物体外稳定性较好，作用时间更长，且在体外细胞处理实验中不需要借助细胞转染试剂。

对miRNA进行过表达可以进一步揭示miRNA功能。在基因水平上，体内构建GAL4/UAS转基因系统已成为过表达miRNA的有效方法，目前已成功应用于果蝇(Vargheseetal., 2010; Chen and Rosbash, 2016)和家蚕Bombyxmori(Liuetal., 2018)等昆虫中。在植物中，过表达miR-14的转基因水稻Oryzasativa可以对二化螟Chilosuppressalis产生高抗性(Heetal., 2019)，过表达Osa-miR162a可以诱导水稻中相关防御基因表达，增强对稻瘟病菌Magnaportheoryzae的抗性(Lietal., 2020)。在非基因水平，注射miRNA类似物(mimic)或激动剂(agomir)是较常用的实验方法，mimic和agomir的作用与成熟miRNA相同，都可以上调细胞内相应miRNA的含量。随着miRNA成为生命科学领域的新热点，上述方法也成为了研究miRNA的得力工具。

2 昆虫miRNA的鉴定

目前已有的报道主要是利用高通量测序技术以及生物信息学等新技术和新手段对不同昆虫中的miRNA进行鉴定并分析其个体表达模式以及在不同应激条件下的表达情况，为研究miRNA的调控机制奠定基础。到目前为止，在miRbase数据库中已有从家蚕、果蝇和小菜蛾Plutellaxylostella等26种昆虫中鉴定的3 508个miRNA(表2)。

表2 miRbase数据库注册的昆虫miRNAs统计

2.1 鳞翅目昆虫中miRNA的鉴定

Ellango等(2014)鉴定了小菜蛾中8个miRNA成熟体的同时预测了其靶标mRNA，并对这些miRNA的前体序列进行分析，通过最小自由能索引(MFEI)对其二级结构进行预测。Etebari和Asgari(2016)重新注释了小菜蛾基因组，对其中高丰度miRNA的5p和3p端特征进行更正，并注释了203个成熟miRNA，鉴定出其中160个pxy-miRNA的7 691个高丰度结合位点，为研究小菜蛾miRNA的功能提供数据支持。基于同源序列搜索以及Northern杂交，He等(2008)鉴定出了家蚕中46个miRNA、另外21个潜在的miRNA以及1个新的miRNA，并根据这些miRNA找到了12对miRNA-miRNA*双链分子。Liu等(2010)在家蚕中初步鉴定得到了一些昆虫变态相关的miRNA，并验证了其组织特异性表达模式，为研究家蚕miRNA的功能提供了理论基础。Fan等(2017)在滞育和经HCl处理后的家蚕的卵中共发现44个新的miRNA，其中经酸处理的卵中有23个miRNA表达量上调，3个miRNA表达量下调，说明经酸性物质处理后可能会影响家蚕卵中与生长发育相关的一些miRNA的表达。Zhang等(2015)在甜菜夜蛾Spodopteraexigua中共鉴定出127个保守的miRNA，其中Sex-miR-10-1a, Sex-miR-9和Sex-miR-4924在昆虫不同发育阶段差异表达。Xu等(2015)在亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis的Cry1Ab敏感和抗性品系幼虫中鉴定并验证了22个已知的miRNA和1个新的miRNA表达量存在显著差异。此外，Yu等(2018)对欧洲玉米螟OstrinianubilalisCry1Ab敏感品系和抗性品系幼虫的中肠miRNA进行建库测序，共得到248个已知的和29个新的miRNA，并验证了抗性品系幼虫中肠15个差异表达miRNA的表达模式。Zhang Z等(2018)鉴定了核桃举肢蛾Atrijuglanshetaohei幼虫期和成虫期的miRNA，共得到132个已知的和7个新的miRNA，其中4个miRNA在成虫期特异表达，17个在幼虫期特异表达，RT-qPCR结果表明miR-8-3p, miR-305-3p和miR-2766均在幼虫期高表达。Jeyaraj等(2017)在物理伤口、茶尺蠖Ectropisobliqua啃食造成的伤口以及正常的茶树叶片中共鉴定出130个已知的和512个新的miRNA，其中36个已知的和139个新的miRNA在经茶尺蠖啃食叶片中特异表达，RT-qPCR结果证实了其中6个miRNA的表达模式，同时他们也发现这些miRNA的靶基因编码了包含乙烯响应转录因子以及squamosa基因启动子绑定蛋白在内的多个转录因子，说明miRNA可能通过调控转录因子的表达参与昆虫应激反应。

2.2 其他昆虫中miRNA的鉴定

Calla和Geib(2015)在橘小实蝇Bactroceradorsalis中鉴定了已知miRNA的75个直系同源miRNA和5个实蝇科特有的新miRNA，并构建了miRNA的基因表达谱，同时也预测了这些miRNA潜在的靶标基因，这为在其他双翅目物种进行比较分析以及为新型害虫防控策略提供潜在靶标奠定了基础。在东方果实蝇Grapholitamolesta各个发育阶段的miRNA中，共鉴定出291个已知的和245个新的miRNA，发现同簇的miRNA具有相关的表达谱，并对17个在节肢动物中保守的miRNA家族进行分析，结果表明这些miRNA家族在昆虫中十分保守并具有更近的系统发育关系(Wang Xetal., 2017)。Lyons等(2016)对胆蝇Eurostasolidaginis幼虫中与低温耐受有关的miRNA进行研究，发现当温度范围在-15～5℃时，共有24个差异表达的miRNA，其中miR-92a在-15℃条件下时表达量明显提高。在嗜人锥蝇Cochliomyiahominivorax和次生锥蝇Cochliomyiamacellaria的成虫以及3龄幼虫中共发现10个进化保守的miRNA和10个可能的前体miRNA，其中6个与生殖相关的miRNA的相对表达模式在这两个物种中相似，说明miRNA调控模式在物种间具有一定的保守性(Pauloetal., 2017)。Seong等(2019)在果蝇DDT敏感和抗性品系中鉴定出10个差异表达miRNA，且其靶基因多与解毒代谢有关，这表明miRNA可能通过调节其靶基因的表达进而在DDT解毒通路中发挥一定的作用。对喂食血液、糖类和被疟原虫感染后的嗜人按蚊Anophelesanthropophagus中肠miRNA进行鉴定，发现与喂食糖类的按蚊相比，喂食血液的嗜人按蚊中肠中有9个miRNA的表达量显著上调，10个miRNA显著下调，而感染疟原虫使按蚊中肠中13个miRNA表达量增加，11个miRNA表达量下降(Liuetal., 2017)。Chang等(2016)在白背飞虱Sogatellafurcifera中共鉴定得到382个miRNA，其中有106个已知的miRNA和276个新的miRNA，并且半数以上的保守miRNA家族在六足类中也是高度保守的。Ylla等(2017)对德国小蠊Blattellagermanica胚胎形成的不同阶段差异表达的miRNA进行测序，并将其与黑果蝇、黑腹果蝇以及赤拟谷盗T.castaneum的进行对比，发现了之前未研究过的一些胚胎细胞miRNA，例如miR-309家族和54个新的miRNA，这些miRNA可参与调控不同时期的胚胎发育过程。Wang YK等(2017)对雌性和雄性榕小蜂Ceratosolensolmsi不同龄期的miRNA进行鉴定后发现一些miRNA的表达具有很高的性别和发育阶段特异性。在暗黑鳃金龟Holotrichiaparallela中鉴定得到了共76个已知的miRNA和23个组织特异表达的新miRNA，对其靶基因进行预测和功能分析后，发现其中有13个miRNA可能与昆虫嗅觉有关(Wang Setal., 2017)。分别对6, 9和12日龄的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica咽下腺总miRNA进行分析，共得到54个在日龄间差异表达的miRNA，其靶基因被注释到生理节律信号通路、Hippo信号通路、嘌呤代谢通路等，GO聚类主要集中在有机物质运输、离子跨膜运输和系统发育等，暗示这些差异表达miRNA可能与咽下腺发育有关(张卫星, 2020)。在耐寒和正常稻水象虫Lissorhoptrusoryzophilus中鉴定得到共121个已知的和14个新的miRNA，其中36个miRNA在耐寒种群与正常种群之间差异表达(Yangetal., 2017)。Jung等(2017)根据东亚飞蝗Locustamigratoria的栖息地、性别和发育阶段将其分为12组进行miRNA测序分析，共鉴定出175个miRNA簇，GO功能分析表明某些miRNA可以在多种生理过程中调节靶标mRNA的表达，从而影响多酚类的分泌。Liu M等(2019)对兰州熊蜂Bombuslantschouensis的雄蜂、工蜂和蜂后脑中的miRNA进行测序，共鉴定得到了364个已知的和89个新的miRNA，并对差异miRNA进行RT-qPCR验证和靶基因分析，为进一步研究miRNA在蜜蜂脑中的功能提供了基础。

3 miRNA在昆虫中的功能

3.1 miRNA与昆虫生长发育

昆虫的生长发育受蜕皮激素和保幼激素的协同作用，miRNA通过调节蜕皮激素级联基因的表达影响昆虫发育及变态过程。家蚕中miR-281特异作用于蜕皮激素受体(EcR)的一个亚型基因BmEcR-B的3′UTR区，通过抑制BmEcR-B的转录水平，延缓家蚕发育过程(Jiangetal., 2013)。miR-2家族作为无脊椎动物特有的家族，同时也在家蚕翅发育中扮演重要角色，miR-2转基因个体在成虫期出现翅畸形的现象，并可以显著抑制靶基因Bmawd和Bmfng的表达(凌琳, 2017)。利用GAL4/UAS系统和CRISP/Cas9技术构建的家蚕miR-14转基因过表达品系和敲除品系表明，当miR-14过表达时，家蚕产生滞育现象、虫体重量降低且蜕皮激素滴度降低；miR-14敲除品系的家蚕则发生早熟行为，miR-14通过调控蜕皮激素信号通路上的核心因子ECR-B和E75影响家蚕生长发育及代谢(Liuetal., 2018)。滞育和经HCl处理后的家蚕的卵中差异表达miRNA的靶基因，多与细胞新陈代谢、蛋白质产生和运输过程有关，其中Bmo-miR-2761-3p通过负向调控靶基因BmSDH的表达影响家蚕卵的发育，进而影响其生长发育(Fanetal., 2017)。Liu ZL等(2019)利用CRISPR/Cas9技术将物种特异的miR-2738敲除后，其性别决定相关靶基因BmPSI和BmMasc转录水平有所上升，这表明miR-2738可能是性别决定基因的一个调控因子，通过负向调控其靶标基因在家蚕性别决定过程中发挥作用。

miR-14作为无脊椎动物中的一个保守miRNA，在果蝇中已被证明可以抑制细胞凋亡驱动基因rapper,grim,hid及dronc的表达水平，延缓细胞凋亡过程(Xuetal., 2003)。miR-14在果蝇成虫脑中通过调控一个锌指蛋白基因sugarbabe，控制果蝇发育及代谢(Vargheseetal., 2010)。对miR-305分别进行过表达和抑制表达后，果蝇寿命明显缩短和延长，过表达时会显著抑制其编码AMP的靶基因以及类胰岛素肽基因dilp6的mRNA表达水平，表明miR-305不仅与果蝇寿命长短有关，还可能在果蝇老化中起作用，其异位表达很可能会加速果蝇的衰老(Uedaetal., 2018)。miR-252在果蝇蛹期和成虫期一般呈现上调趋势，在幼虫脂肪体中过表达会使果蝇各组织重量下降，蛹期到成虫期的发育历期延长，将其敲除则使果蝇组织重量上升；同时过表达miR-252和靶基因mbt则会使果蝇的发育缺陷得到恢复，这表明miR-252可能通过调控mbt的表达参与果蝇的生长发育过程(Limetal., 2019)。东方果实蝇各个发育阶段的miRNA进行从头测序、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析和靶基因预测表明，由miRNA、时钟基因和发育调控相关基因组成的复合物在调控东方果实蝇的生理发育节律中起着重要作用(Wang Xetal., 2017)。

埃及伊蚊作为虫媒病毒的重要传播载体，研究其生殖调控机制对制定虫媒控制策略、限制虫媒疾病的传播有重要意义。Bryant等(2010)发现，miR-275在血液消化、流体排泄和卵的发育中均发挥重要作用。miR-1174在埃及伊蚊肠道中特异表达，并靶向丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT)以控制肠道内的血液摄入和消化，进而影响卵发育，miR-1174的缺失会导致糖吸收和血液摄入的严重缺陷(Liuetal., 2014)。miR-8通过调节雌蚊脂肪体内Wingless-interactingmolecule(Swim)的表达影响远程Wingless(Wg)信号的传导，miR-8/Wg对于脂肪体适当分泌脂激蛋白、卵黄生成素以及卵黄蛋白前体发育成卵母细胞后的积累至关重要(Lucasetal., 2015)。研究表明miR-309在卵巢发育启动过程中充当调节开关的角色，吸食血液能够刺激其表达；同时miR-309也参与介导SIX4周期性降解，使卵巢发育从卵黄发生前阶段过渡到卵黄发生后阶段，将其敲除会影响初级卵泡形成，导致卵巢发育受损，影响卵发育成熟(Zhangetal., 2016)。在埃及伊蚊中，miR-277也可以通过微调insulin-likepeptide7(ILP7)和ILP8的表达来调节脂质代谢，从而控制促性腺营养周期中卵巢发育启动所需能量的转移，将miR-277或靶基因ILP7/ILP8敲除后，均可导致昆虫的脂质代谢和卵巢发育缺陷(Lingetal., 2017)。

发育同步性是群居动物适应环境的重要策略之一，是群居动物群体形成、迁移和性成熟的基础。对群居型蝗虫和寡居型蝗虫的卵孵化时间进行的研究表明，群居型蝗虫个体的性成熟同步性明显优于寡居型蝗虫，其中miR-276在群居型蝗虫个体的卵巢和卵中的表达量均显著高于寡居型蝗虫，miR-276通过正向调控转录共激活因子Brahma(Brm)的表达使昆虫后代同步孵化，对其进行干扰会导致昆虫性成熟同步性的紊乱(Heetal., 2016)。在东亚飞蝗中miR-2/13/71簇(miR-2, miR-13a, miR-13b和miR-71)通过抑制靶基因Notch的表达，从而降低卵黄原蛋白(Vg)mRNA的转录水平，抑制卵母细胞成熟，影响东亚飞蝗的卵巢发育和生殖(Songetal., 2019)。

miRNA也与昆虫几丁质的合成过程有关。Yang等(2016)发现miRNA也与昆虫几丁质的合成过程有关，miR-71和miR-263通过调控其靶基因chitinsynthase1(CHS1)和chitinase10(CHT10)的表达影响蝗虫蜕皮，注射miR-71和miR-276 agomir可显著降低CHS1和CHT10的表达，影响新老角质层几丁质的产生，导致蝗虫的蜕皮缺陷。Chen等(2018)的研究表明在褐飞虱Nilaparvatalugens中，nlu-miR-173通过与转录因子NlFtz-F1结合参与20E信号通路，且Broad Complex (Br-C)可以提升nlu-miR-173的转录水平，进而在昆虫蜕皮过程中发挥作用。miR-2703通过靶向chitinsynthase1a(CHS1a)响应20E信号通路以调节几丁质合成，饲喂或注射miR-2703 mimic会导致昆虫几丁质合成降低、死亡率增加并出现蜕皮缺陷表型(Chenetal., 2020)。在长期适应自然环境的过程中，褐飞虱进化出长翅(LW)和短翅(SW)两种翅型，其中胰岛素受体(lnR)和保幼激素(JH)在调节翅多型性中起着重要作用，但是这些调节因子之间的相互作用尚未明确。Ye等(2019)发现，miR-34在短翅褐飞虱中高表达，通过抑制NllnR1的转录水平影响昆虫的翅多型性现象，在长翅褐飞虱中过表达miR-34可促使其向短翅转变，在短翅褐飞虱中敲除miR-34则会导致其向长翅转变。该研究团队还在nlu-miR-34的启动子区发现了Br-C的顺式响应元件，这表明20E可能参与了翅多型性现象的调控；此外，JH通过上调miR-34的表达水平诱导更多短翅褐飞虱的产生，敲除胰岛素/IGF信号(IIS)通路上的某些基因也会使JH滴度和miR-34的丰度提高，这表明miR-34是JH， 20E和IIS通路间的一个重要调节因子，使其三者形成一个正反馈回路，协同调控昆虫翅多型性(Yeetal., 2019)。

Zhang Z等(2018)鉴定了核桃举肢蛾各个发育阶段的miRNA，发现miR-1a-3p, miR-133, let-7, miR-2766, miR-184和miR-34可能与昆虫背腹轴形成、激素合成以及生理节律等生长发育过程有关。在昆虫翅形态发生、组织死亡及神经细胞转导形成相关的miRNA中发现miR-2可以控制Kr-h1的转录水平，进而影响德国小蠊在半变态过程中的形态发育，这也是单个miRNA作为重要的调节因子影响昆虫整个生理过程的典型例子(Belles, 2017)。Ylla等(2017)参考了德国小蠊的miRNA文库，发现在不完全变态个体中，一些miRNA在蛹期和成虫期会有多种表达模式，表明某些miRNA可以参与昆虫发育过程，促进发育期的转变，甚至可能影响胚芽带类型和变态模式。赤拟谷盗中miR-8-3p与昆虫的生长发育和变态过程密切相关，在幼虫晚期抑制其表达会导致翅、眼、足及胚胎的发育缺陷，且靶基因Wingless,Eyg,Fpps和Sema-1a均与机体发育相关，其中Eyp和Wingless作为关键调控基因参与Notch和Wingless信号通路，并影响昆虫变态(Wu Wetal., 2019)。棉铃虫Helicoverpaarmigera的miRNA生物合成途径中的关键基因Pasha,Drosha,Exportin-5,Dicer-1及Argonaute-1在不同组织和不同龄期中表达量均有差异，沉默Dicer-1可导致let-7和miR-184表达量上升，并会抑制miRNA生物合成途径的发生，导致幼虫死亡、蛹期延长和成虫翅发育畸形(Rahimpouretal., 2019)。在斜纹夜蛾Spodopteralitura中，miR-14-3p通过靶向两个蜕皮激素级联基因EcR和E75来调节昆虫蜕皮激素信号通路。此外，EcR,E75和Kr-h1等蜕皮激素级联基因不同转录本间的3′UTR区基本相似，表明一个miRNA也可能调控一个蜕皮激素级联基因的多个转录本(Luoetal., 2020)。橘小实蝇的miR-1-3p在雌性性别决定基因Bdtra上存在靶位点，通过抑制其表达影响橘小实蝇的性别分化，注射miR-1-3p mimic会导致87%～92%的雄性表型，注射inhibitor则会导致67%～77%的雌性表型，敲除miR-1-3p后会导致Bdtra和Bddsx的雌性特异剪接转录本的表达，并且诱导XY个体的性别逆转为雌性(Pengetal., 2020)(表3)。

表3 昆虫生长发育相关miRNAs及其靶基因

续表3 Table 3 continued

3.2 miRNA与昆虫行为

在东亚飞蝗两型转变的行为中，miR-133靶向多巴胺合成通路的两个关键基因henna和pale，下调其表达会抑制多巴胺合成，促使飞蝗由群居型转变为寡居型(Yangetal., 2014)。D1-like dopamine receptor(Dop1)通过阻止La蛋白和pre-miR-9a结合，抑制成熟miR-9a产生，上调其靶基因AC2的表达水平，进而诱导东亚飞蝗对群居性挥发物的嗅觉偏好(Guoetal., 2018)。Sadd等(2015)通过对欧洲熊峰Bombusterrestris和美洲东部熊蜂Bombusimpatiens进行研究，并将其与蜜蜂以及其他膜翅目昆虫进行比较，发现其miRNA的差异表达很可能与调控社会行为或其他行为特征的基因有关。跳舞作为西方蜜蜂Apismellifera特有的传输方向和距离的交流方式，其中也不乏miRNA参与。对处于不同觅食阶段工蜂的研究表明，ame-miR-278和ame-miR-282在跳舞阶段的表达量低于觅食阶段，其靶基因均与激酶、神经功能以及突触结合蛋白等相关，觅食和舞蹈阶段的miRNA差异很可能与蜜蜂的跳舞行为有关(Lietal., 2012)。果蝇的miR-276a通过抑制重要的时钟基因timeless(tim)的表达调控其行为节律，敲除tim中miR-276a的结合位点会导致tim表达量上升，致使果蝇心律失常(Chen and Rosbash, 2016)。miR-210通过抑制Fasciclin2(Fas2)来决定果蝇的夜间行为，miR-210缺失会导致果蝇提前2 h出现夜晚的某些行为，敲除Fas2上miR-210的靶位点也会导致果蝇夜间行为的提前(Niuetal., 2019)。一些miRNA还可能与昆虫的求偶行为有关，研究表明黑腹果蝇的求偶行为有时会根据求偶对象释放的信号而改变，这一适应性的行为被广泛认为是miRNA和其他因子共同作用的结果。miR-957突变体果蝇呈现显著上升的雄-雄求偶行为和雄性群体中互相求偶的链式行为，这表明单个miRNA也可能调控多种复杂行为(Iftikharetal., 2019)。在感染Wolbachia的果蝇中，dme-miR-92b通过负向调节其靶基因crebA的表达影响果蝇的神经发育和学习记忆能力(Bietal., 2019)。尽管miRNA对神经元可塑性的调节作用被认为是真核生物中的一种保守机制，但仅有少量研究表明，miRNA也可以在昆虫学习与记忆方面发挥作用(Rajasethupathyetal., 2009; Linetal., 2011)。Cristino等(2014)发现，在蜜蜂中与神经蛋白相关的miR-932可通过调节肌动蛋白基因Act5C的表达对蜜蜂的长期记忆产生影响，该miRNA的缺失导致蜜蜂长期记忆的损伤，但并不会影响其记忆的获取(表4)。

表4 昆虫行为相关miRNAs及其靶基因

3.3 miRNA与昆虫抗病毒机制

目前，miRNA与抗病毒机制的相关研究主要集在果蝇和家蚕这两种模式生物中。病毒主要通过调节宿主免疫反应和逃避宿主免疫系统识别等方法达到持续感染宿主细胞的目的(Stern-Ginossaretal., 2007; Xiaetal., 2008)。在与宿主长期的互作过程中，病毒也进化出多种策略逃避宿主免疫系统识别，其中利用miRNA对宿主进行干扰有助于病毒的快速传播(Tangetal., 2019)。对病毒感染下的miRNA表达模式进行分析已成为寻找宿主昆虫-病毒互作相关miRNA的主要方法。

3.3.1病毒编码的miRNA与宿主昆虫-病毒互作：病毒可以通过编码miRNA调节宿主基因表达，从而参与宿主昆虫与病毒互作的生物过程。病毒编码的miRNA具有长度短、非抗原性以及靶点特异性等优势，这使其成为病毒对抗寄主防御机制的潜在武器。第一个鉴定得到的昆虫病毒miRNA是由棉铃虫囊泡病毒(Heliothisvirescensascovirus, HvAV)编码的HvAV-miR-1，其表达可以引起病毒DNA聚合酶Ⅰ的降解，从而抑制病毒复制(Hussainetal., 2008)。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一种天然病原体，侵染后能有效调控宿主基因表达并在体内产生大量的病毒后代，染病家蚕死亡率极高，对桑蚕业造成了严重的经济损失。为探究BmNPV与宿主防御系统的互作机制，Singh等(2010)预测了部分病毒编码的miRNA以及其64个潜在靶点，揭示了miRNA可以通过调控部分病毒复制基因和寄主免疫防御通路关键基因的表达，从而在促进病毒侵染宿主昆虫的过程中发挥作用。此外，一些病毒miRNA也可能通过抑制宿主miRNA合成途径中的重要蛋白合成对昆虫抗病毒能力产生影响，例如BmNPV可通过编码一种miRNA(BmNPV-miR-1)，下调寄主GTP结合核蛋白Ran的表达，使Ran与Exportin-5的结合效率降低，抑制了miRNA前体从细胞核到细胞质的迁移，从而增加感病家蚕中BmNPV的拷贝数(Singhetal., 2012)。该研究团队还发现在BmNPV病毒感染早期，BmNPV-miR-3可以通过负调控病毒P6.9和其他晚期基因的表达来逃避宿主的免疫防御，促进BmNPV对宿主的感染(Singhetal., 2014)。除BmNPV外，家蚕细胞质多角体病毒(Bombyxmoricytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV)也是一种严重危害养蚕业的重要病原体。Guo等(2020)研究表明，BmCPV-miR-1通过上调凋亡蛋白抑制基因BmIAP的表达抑制感病家蚕的细胞凋亡，为病毒的复制提供更好的细胞环境。

3.3.2昆虫编码的miRNA与宿主昆虫-病毒互作：有些昆虫编码的miRNA在受到病毒感染后会发生表达谱变化，这种变化揭示了昆虫miRNA在宿主-病毒互作中的潜在作用。Monsanto-Hearne等(2017)通过对比感染了果蝇C型病毒(DrosophilaC virus, DCV)和未染病果蝇的miRNA表达谱，发现二者之间miR-956-3p的丰度存在显著差异，该miRNA通过在DCV感染期间诱导其靶基因Ectoderm-expressed4(Ect4)的表达，降低病毒聚集率，延缓果蝇死亡，启动染病果蝇体内的宿主保护机制和抗病毒机制。Wu P等(2019)发现在感染BmNPV的家蚕中，bmo-miR-2819的表达下调，过表达该miRNA后其靶标基因BmNPVIE-1的丰度相应降低并抑制了病毒的复制，这表明宿主miRNA可以通过调控病毒基因的表达抵御病毒的侵染。

某些病毒也可以利用宿主细胞miRNA加速自身复制过程，促使宿主昆虫染病。Wu等(2016)研究表明，在感染BmCPV的家蚕幼虫中，过表达miR-278-3p可以显著降低其靶基因Insulin-relatedpeptidebindingprotein2(IPB2)的表达，同时显著提高BmCPV的mRNA转录水平，加速其复制。此外在染病幼虫中，miR-273-3p也能够通过负向调控病毒Nonstructuralprotein5(NS5)基因的表达，增加BmCPV的拷贝数，加速家蚕染病过程(Wuetal., 2017)。Campbell等(2014)构建了经登革热2型病毒(DENV-2)处理2, 4和9 d后的埃及伊蚊Aedesaegypti深度测序文库，发现经过9 d的处理后，起显著调节作用的miRNA数量由5个上升为23个，对这些miRNA的靶标基因进行预测后，发现其均与转录调节、信号转导、染色质修复和线粒体功能等病毒复制传染过程有关。蜜蜂作为重要的昆虫传粉者，感染病毒后其授粉效率显著降低，感染缓慢性蜜蜂麻痹病病毒(slow bee paralysis virus, SBPV)和以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)的欧洲熊蜂Bombusterrestris的miRNA合成通路基因以及表达模式分析显示，在SBPV侵染后Dicer-1和Ago-1的表达量有所提高，且有17个miRNA在SBPV感染群体特异表达，12个miRNA在IAPV感染群体中特异表达，对这些miRNA的靶基因进行分析后发现寄主昆虫miRNA可能会靶定调控病毒基因组RNA(Niuetal., 2017)。在埃及伊蚊中，感染沃尔巴克氏菌Wolbachia可显著诱导aae-miR-2940和其靶基因metalloprotease(MetP)的表达，沉默aae-miR-2490和MetP则会导致体内外Wolbachia密度降低，宿主miRNA可通过调节胞内环境以促进Wolbachia内共生，与病原菌进行互作(Hussainetal., 2011)。Dubey等(2019)发现，miR-2944b-5p通过与基孔肯雅病毒(Chikungunya virus, CHIKV)的3′UTR结合影响病毒复制，注射antagomir抑制miRNA会导致病毒复制加快，此外，在病毒复制过程中，miR-2944b-5p靶向vps-13以维持埃及伊蚊线粒体膜电位。Su等(2019)对喂食DENV-2污染血液后染病和未染病埃及伊蚊的miRNA分析发现17个显著差异表达的miRNA, miR-1767和miR-276-3p会加速病毒复制，miR-4448则会减缓病毒复制(表5)。

表5 与昆虫-病毒互作相关的miRNAs及其靶基因

3.4 miRNA与昆虫免疫机制

昆虫作为无脊椎动物没有适应性免疫，当被外源病原体入侵时，主要通过Toll途径和免疫缺陷(IMD)途径激活体内的细胞免疫和体液免疫，细胞免疫主要包括淋巴细胞介导的吞噬、包被和结节作用，体液免疫是通过昆虫脂肪体产生体液反应分子，如抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)以及一些抗病毒因子和黑色素等来实现的(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。其中，AMP的产生、黑化以及细胞吞噬作用是最重要的防御机制。由于miRNA在转录后水平调控基因表达，其在昆虫免疫机制中也可能发挥着重要作用。在球孢白僵菌Beauveriabassiana侵染后的斯氏按蚊Anophelesstephensi的研究中发现，在侵染早期，bba-milR-1可以显著下调宿主Spz4的表达，进而抑制Toll介导的蚊虫免疫；但在侵染晚期，真菌菌丝进入昆虫血腔后，bba-milR-1和靶基因CLIPB9的表达均显著降低以避免酚氧化酶原(PPO)转化为酚氧化酶(PO)，进而避免蚊虫黑化反应的激活(Cuietal., 2019)。在冈比亚按蚊Anophelesgambiae中，aga-miR-305可以通过免疫效应基因的转录后修饰对抗疟原虫的中肠微生物群进行调节，从而影响昆虫的免疫机制(Dennisonetal., 2015)。通过对种系缺陷的秀丽隐杆线虫的寿命和免疫机制的研究发现，一些miRNA的调节因子与昆虫的寿命延长有关(Sinha and Rae, 2014)。miR-8是一个昆虫中高度保守的miRNA，在调节昆虫发育、内分泌以及先天免疫内稳态中起着重要作用(Karresetal., 2007; Kennelletal., 2008, 2012; Jinetal., 2012)。对果蝇Toll, IMD和JNK免疫通路上一些保守miRNA分析发现，miR-8可能通过靶标Toll通路上的GNBP3和JNK通路上调节因子Pvf来调控AMP的表达，进而在果蝇先天免疫反应中发挥作用(Fullaondo and Lee, 2012)。在小菜蛾中，miR-8可以正向调控丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Serpin27的转录水平，调节免疫反应中Toll途径的激活；并且在感染了寄生虫的弯尾姬蜂Diadegmasemiclausum体内，miR-8的下调会导致Serpin27的表达量显著降低，进而导致Toll途径的激活和AMP的大量产生，同时也促进PO活性的增强以及黑化反应的激活(Etebari and Asgari, 2013)。Xiong等(2016)发现，miR-34通过抑制其靶基因Dlg1和Eip75B的表达调节果蝇先天免疫并参与蜕皮激素信号通路，是二者复杂的相互作用中的关键节点，过表达miR-34可以激活天然抗菌免疫信号，使感染革兰氏阴性菌的果蝇存活率和病原菌清除率均有所提高。Wei等(2018)在3个时间点对感染了滕黄微球菌Micrococcusluteus的果蝇雄成虫进行miRNA和mRNA表达模式分析，发现感染后的各个时间点，miRNA和mRNA的表达量均有差异，说明一些差异表达的基因在Toll等信号通路中起着重要作用，miRNA可能在不同的信号通路中协同调节基因表达，促进或抑制昆虫先天免疫反应以及维持昆虫自稳态。果蝇中miR-317可直接靶向Dif基因的一个转录本Dif-Rc以下调Drc的表达水平，且miR-317仅作用于Dif-Rc，而不作用于Dif-Ra/b/d，表明miR-317可以调节一个可变剪接基因的不同亚型从而负向调控果蝇的免疫应答；此外，过表达miR-317会提高果蝇革兰氏阳性菌感染死亡率，敲除miR-317则会降低其死亡率，因此miR-317不仅可以影响果蝇的先天免疫功能，还可以通过干扰免疫系统影响果蝇生存(Li Retal., 2019)。Xu等(2017)建立了感染玫烟色棒束孢Isariafumosorosea的小菜蛾miRNA文库，并验证了其中23个差异表达miRNA的表达模式发现miR-2, miR-9a, miR-745和miR-7b均在小菜蛾抵御病原菌的过程中发挥作用(表6)。

3.5 miRNA与昆虫抗药性

传统农业生产上对化学农药的过度依赖导致了害虫抗药性的产生，解决重大农业害虫的抗药性问题已成为了目前害虫防治工作的重中之重。由于miRNA在基因转录后调控中扮演着重要的角色，其通过调节昆虫解毒基因表达来增强自身抗药性的分子机制也引起了广大害虫防控工作者的兴趣(表7)。Li等(2015)的研究首次表明，小菜蛾可利用miR-7a和miR-8519上调鱼尼丁受体(ryanodine receptor, RyR)的表达，进而增强对氯虫苯甲酰胺的抗性。这证实了miRNA可以通过调控宿主靶基因的表达从而参与其对杀虫剂的解毒过程。经氯虫苯甲酰胺处理后，小菜蛾幼虫体内miR-2b-3p和miR-14-5p的丰度显著降低，其靶基因CYP9F2和CYP307a1在转录水平上过表达，并通过饲喂幼虫miR-2b-3p mimic，发现溴氰菊酯抗性品系幼虫死亡率明显提高，表明miR-2b-3p可以负向调节CYP9F2的表达，并有效抑制幼虫解毒代谢通路(Etebarietal., 2018)。随后Li S等(2019)构建了暴露在Bt下不同时长的小菜蛾miRNA文库并进行了差异miRNA表达分析，发现miR-2的表达量在杀虫剂暴露后有所上调，且miR-2b-3p可负向调控trypsin的表达，这表明miR-2b-3p可能在小菜蛾对苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)的防御机制中发挥作用。Zhu等(2019)的研究表明，miR-998-3p通过负向调控ABCC2的表达，参与棉铃虫H.armigera、甜菜夜蛾和小菜蛾这3种典型的鳞翅目害虫对BtCry1Ac毒素的解毒过程。Zhang Y等(2018)发现在朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus中，属于miR-1家族的tci-miR-1-3p在抗性品系幼虫中的表达量很低，在tci-miR-1-3p过表达时，该miRNA的一个预测靶基因TCGSTM的表达量明显降低，利用双荧光素酶报告系统实验进一步证实了两者之间存在明显的相互作用，这表明tci-miR-1-3p通过调节TCGSTM的表达，进而在螨类对丁氟螨酯的抗性中发挥重要作用。Morin等(2017)验证了经吡虫啉处理和未经处理的马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata中的miRNA的表达模式，发现miR-282, miR-989和miR-100在昆虫对吡虫啉的解毒中发挥重要作用，并揭示了响应吡虫啉刺激的马铃薯甲虫miRNA的特征。对西方蜜蜂的噻虫嗪抗性品系和敏感品系中的miRNA鉴定发现，有7个miRNA在两个品系中差异表达，其靶基因多与昆虫行为、免疫功能、神经功能以及对杀虫剂的解毒作用等相关(Shietal., 2017)。Lei等(2014)发现，miR-278-3p通过负向调控其靶标基因CYP6AG11的表达改变淡色库蚊C.pipienspallens对拟除虫菊酯的敏感性。此外，Guo等(2017)首次对淡色库蚊中的miRNA簇进行研究，发现miR-2～13～71可通过调节其靶基因CYP9J35和CYP325BG3的表达参与昆虫对拟除虫菊酯的解毒过程。同样在淡色库蚊中，miR-932通过负向调控其靶基因CpCPR5的表达改变其对溴氰菊酯的敏感性(Liuetal., 2016)。Ma等(2017)发现miR-92a在溴氰菊酯抗性品系中相对于敏感品系过表达，进一步通过注射抑制剂将miR-92a抑制后可导致其靶基因cpCPR4表达量增加，同时抗性品系对溴氰菊酯的易感性也有所提高。该研究团队还发现miR-13664在敏感品系中的丰度显著高于抗性品系，过表达或抑制其表达会显著影响淡色库蚊对溴氰菊酯的敏感性，下调其靶基因cpCYP314A1的表达会降低淡色库蚊对溴氰菊酯的抗性(Sunetal., 2019)。上述淡色库蚊耐药机制相关研究均为防治蚊虫抗药性提供了新的科学依据。Seong等(2019)的研究表明，DDT处理会显著下调果蝇Canton-S敏感品系中miR-310-3p, miR-311-3p, miR-312-3p, miR-313-3p和miR-92a-3p的表达，这与其细胞色素P450相关靶基因的表达模式相反，表明这些miRNA可能通过转录后调控P450靶基因的表达从而参与对DDT的解毒代谢过程。

表6 昆虫免疫相关miRNAs及其靶基因

表7 昆虫抗药性相关miRNAs及其靶基因

4 小结与展望

自20世纪90年代首次报道以来，miRNA日渐成为生命科学领域研究的新热点。随着生物信息学、生物化学与分子生物学和遗传学等各个领域的研究不断深化以及测序技术的飞速发展，研究人员已完成了多个物种的miRNA的鉴定和功能验证。此外，以生物信息学为基础的各种预测软件的面世和转录组学的发展，揭示了miRNA和其靶基因之间潜在的复杂调控网络以及miRNA在调节各种生物学过程中的功能可塑性，扩展了人们对基因转录后调控进程的理解。值得注意的是，miRNA与其靶基因之间的调控网络可能还存在其他重要的调节因子，例如一些转录因子可与启动子结合激活或抑制基因表达。在一些情况下，miRNA的缺失或突变不会引起生物体表型的显著变化，但转录因子的突变则可以造成显著的表型变化。多种生物的全基因组遗传分析也表明转录因子在生物体发育和自稳态等过程中发挥决定性作用，而miRNA则是通过微调靶基因的表达，进而对生物体的形态、生理及行为产生影响，此时转录因子可作为调控共同靶基因的“主因子”，miRNA则起辅助作用，二者协同参与基因表达调控网络(Martinez and Walhout, 2009)。因此，今后在研究miRNA的功能时可能也需要考虑到其他因子对靶标基因的调控作用。

昆虫作为和人类生产生活联系较紧密的物种，其miRNA的鉴定及其生物学功能的研究也越来越受到重视。大量研究表明，miRNA可以通过调节靶标基因的表达，参与多种生物学进程，如昆虫生长发育、行为、昆虫-病毒互作、昆虫免疫和昆虫抗药性。其中，大量的miRNA已被证明在昆虫蜕皮、变态、卵子发生、胚胎发育、翅发育和性别分化等方面均发挥着重要的作用，并与昆虫行为变化有着千丝万缕的联系。在昆虫-病毒互作关系中，病毒编码的miRNA一方面可以提高病毒复制相关基因的表达，加速病毒侵染，另一方面也可以抑制宿主免疫相关基因的表达，从而使病毒能够顺利侵染宿主昆虫。为抵御病毒侵染，昆虫宿主miRNA可以通过多层次的调控机制调节自身免疫相关基因，进而激活昆虫免疫应答或抑制病毒复制。为适应杀虫剂这一重要的环境应激因子，昆虫miRNA一般通过靶向过表达或抑制杀虫剂靶标基因或解毒酶基因的表达来形成或增强杀虫剂抗性。开展对昆虫miRNA的功能研究，有利于提高我们对昆虫基因表达调控网络的深入理解，同时利用特定miRNA调控昆虫抗药性和免疫防御通路上的重要靶基因，也为害虫生态防控策略的制定提供了新思路。

此外，miRNA还可用于转基因植物中，抑制害虫的关键靶标基因，阻碍害虫发育，或通过干扰害虫消化系统以阻止它的取食行为，避免造成更大的危害。也可以通过改造家蚕和蜜蜂等经济昆虫致命病原体的载体，使其产生抗病毒或抗寄生虫的miRNA，抑制病毒复制和寄生虫繁殖，预防家蚕和蜜蜂等经济昆虫的疾病。

虽然昆虫miRNA的功能研究已经取得了较大进展，但依旧存在一些不足之处，如在非模式昆虫中，对于CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除和基于转基因技术的基因敲入相关研究与应用相对较少，使得目前对大量新发现的miRNA的功能验证存在一定难度。

对于某些在脊椎动物和无脊椎动物中系统发育高度保守的miRNA和一些在生长发育、形态发生、细胞分化、神经发生、凋亡和肌肉发育调控途径这些保守通路上的miRNA来说，一些模式昆虫可作为理想的研究材料，对这些昆虫中的保守miRNA的研究也有利于深入了解癌症和心脏病等疾病的分子机制。