RNAi抑制小菜蛾Br-Z2/3基因对下游细胞凋亡基因表达及化蛹的影响

胡晓汉, 田素芬, 李亚勍, 林 硕, 陈艺欣, 魏 辉,顾晓军,2,*, 黄劲飞,2,*, 王曦莹, 李志华

(1. 福建农林大学植物保护学院, 福州350002; 2. 福建省农业科学研究院, 福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福州350003; 3. 福建省农业科学研究院, 农业农村部福州作物有害生物科学观测试验站, 福州 350013)

小菜蛾Plutellaxylostella属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，在全世界140多个国家以及中国各地区普遍发生，幼虫取食十字花科作物，寄主包括甘蓝、芥蓝、花菜、白菜、萝卜、油菜等重要经济作物(https:∥www.cabi.org/isc/datasheet/42318; Zhuetal., 2011; 柯富士等, 2019)。据统计，由该虫所造成的损害及其控制成本每年全球累计达40～50亿美元(Furlongetal., 2013)，中国达7.7亿美元(Lietal., 2016)。长期以来小菜蛾的防治主要依靠各类农药(包括化学农药和生物农药)的使用，但小菜蛾几乎对各种农药都能在短时间内迅速产生高水平抗性，而农药使用后产生的农药残留也可能污染环境和损害人体健康。可见，小菜蛾防治急需新的防治思路。

参与昆虫蜕皮、变态、生殖等重要生理过程及响应病原侵染、农药等不良因子胁迫的相关基因的表达均受转录因子的调控(Guoetal., 2018; Heetal., 2020; Palli, 2020； 赵国栋等, 2020)，因而转录因子在害虫控制及新农药开发中具有良好的应用前景(Guoetal., 2018; Zhaoetal., 2018)。在众多转录因子中，全变态昆虫蛹期蜕皮激素的初级响应基因Br在害虫控制中的应用价值则尤为值得关注。其对化蛹的调控机制是全变态昆虫末龄幼虫体内保幼激素消失、蜕皮激素引发Br大量表达，进而结合下游靶基因如caspase家族基因Dronc及reaper,hid和Drice等细胞凋亡关键基因的启动子区域，启动化蛹进程(Jiangetal., 2000; Lee and Baehrecke, 2001; Cakourosetal., 2002; Leeetal., 2002; Kilpatricketal., 2005)。

在小菜蛾中，目前发现了Br-Z2/3及Br-Z7两种Br异构体，其中Br-Z2/3在预蛹期表达水平最高(超过表达最低成虫阶段的300倍以上)，其次是在4龄幼虫末期(水平超过成虫的100倍)，与小菜蛾化蛹关系更为密切(Huangetal., 2019)。通过dsRNA饲喂法处理小菜蛾4龄幼虫后，虽然靶标基因Br-Z2/3表达降低了40%，但是也有近40%的试虫成功化蛹(Huangetal., 2019)，说明RNAi效率不高。本研究一方面拟采用dsRNA显微注射法实施RNAi，以期提高RNAi效果；另一方面拟采用原核表达法合成dsRNA，代替先前的试剂盒体外合成，以期提高dsRNA合成效率。应用大肠杆菌EscherichiacoliHT115表达获得dsRNA具有合成时间短、合成量大、成本低的优点，已在多种鞘翅目、直翅目昆虫中成功应用过(Ratzkaetal., 2013)。其原理是将L4440 载体(含有双向 T7 启动子和 lac乳糖操纵子)转化入大肠杆菌HT115。由于大肠杆菌HT115是RNase Ⅲ缺陷型菌株，故诱导该菌表达的目的基因 dsRNA不会被RNase Ⅲ酶切降解(Newmarketal., 2003)。基于此，本研究采用原核表达系统大量合成Br-Z2/3 dsRNA，注射法处理小菜蛾4龄幼虫后考察试虫Br-Z2/3与细胞凋亡基因reaper,caspase-9和Gadd45g表达及其化蛹变化，以期进一步阐明Br-Z2/3对小菜蛾化蛹的调控机理及其在小菜蛾防治中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试虫源为本实验室长期室内饲养的小菜蛾敏感种群，幼虫寄主植物为萝卜苗。具体饲养方法条件：将萝卜种子浸泡过夜后，再用75%百菌清可湿性粉剂(或50%多菌灵可湿性粉剂)的500倍稀释液浸泡40 min消毒，冲洗滤干，然后将经高温湿热灭菌处理的营养土平铺在长方形不锈钢托盘(40 cm×20 cm)内(厚3～3.5 cm)，充分浇水后均匀撒播萝卜种子，待萝卜苗长至约6 cm高时，饲喂小菜蛾幼虫(韩艺欣等, 2019)。集中收集蛹置于养虫笼(长×宽×高=25 cm×25 cm×30 cm)中，成虫羽化后以10%(w/v)蜜糖水补充营养，剪取鲜嫩萝卜苗(6 cm)，将萝卜苗榨汁后，均匀涂于铝箔锡纸(10 cm×10 cm)(购自郑州鸿富源工贸有限公司)供成虫产卵，饲养温度25±1℃，相对湿度70%±5%，光周期16 L∶8D。

1.2 小菜蛾总RNA提取和cDNA第1链的合成

由于Br-Z2/3基因在预蛹期高表达(Huangetal., 2019)，故于小菜蛾的预蛹期取样(陈艺欣等, 2011)，-80℃保存备用。参考天根生化科技(北京)有限公司总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，参考全式金生物技术有限公司的反转录试剂盒说明书合成cDNA第1链，-20℃保存备用。

1.3 dsRNA表达载体的构建

根据本课题组前期研究已经上传NCBI的小菜蛾Br-Z2/3基因序列(GenBank登录号: MG753773.1)，并以pIZT/v5-his载体中GFP序列为阴性对照，利用Primer 5.0软件设计一对扩增Br-Z2/3基因干扰片段和GFP的引物。分别在Br-Z2/3正反向引物的5′端加上SacⅠ和KpnⅠ酶切位点，以及在GFP正反向引物的5′端加上SacⅠ和SalⅠ酶切位点。引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，序列详见表1。

表1 本研究所用引物

分别以1.2节合成的预蛹期小菜蛾cDNA和pIZT/v5-his质粒为模板，使用采购自南京诺唯赞公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增Br-Z2/3基因RNA干扰片段及GFPRNA干扰对照片段。PCR反应程序: 95℃预变性3 min; 95℃ 15 s, 59℃ 15 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃ 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并利用凝胶回收试剂盒(天根生化科技北京有限公司)回收并纯化上述PCR产物后，连接pEASY-Blunt Cloning载体，将阳性克隆菌液送至福州尚亚生物技术有限公司测序。

使用内切酶SacⅠ和KpnⅠ双酶切pEASY-Blunt-Br-Z2/3质粒和L4440空载体，并使用内切酶SacⅠ和SalⅠ双酶切 pEASY-Blunt-GFP质粒及L4440空载体(酶切时间均为3 h)，凝胶回收后，将目的片段和L4440载体线性化片段在16℃环境中用T4连接酶过夜连接。连接产物再转化至大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，涂板对应抗性LB固体培养基培养过夜，挑取阳性单克隆菌落扩大培养，进行酶切验证。

1.4 dsRNA表达载体的诱导表达

将1.3节构建成功的含小菜蛾Br-Z2/3基因以及GFP基因片段的dsRNA表达载体 L4440-Br-Z2/3和L4440-GFP转化至大肠杆菌HT115感受态中，涂板对应抗性平板培养过夜，挑取阳性单克隆后用T7引物扩增检测转化是否成功。挑取含有dsRNA表达载体的单菌落接种于20 mL LB液体培养基(含50 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL四环素20 μL)，37℃ 200 r/min振荡培养至菌液OD600=0.4～0.6，加入IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导，再继续培养4 h，诱导dsRNA表达载体表达，收集菌液，采用细胞总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取RNA，-80℃保存备用。

1.5 显微注射法介导RNA干扰

根据小菜蛾4龄幼虫体型特征(陈艺欣等, 2011)，挑取生长日龄相同、体型一致的4龄第2天小菜蛾幼虫80头随机放入8个直径5 cm底部垫有湿润滤纸的塑料培养皿中，每皿10头。 在温度25±1℃、相对湿度70%±5%、光周期16L∶8D条件下，用新鲜萝卜苗饲喂12 h。处理组、对照组各4个培养皿小菜蛾4龄幼虫分别注射100 nLBr-Z2/3 dsRNA(处理组)和100 nLGFPdsRNA(阴性对照)，dsRNA浓度约为1 000 ng/μL，采用Nanoject Ⅲ显微注射器(购自武汉盖尔德纳科技有限公司，型号3-000-207)，注射部位为小菜蛾4龄第2天幼虫第3腹节背板，每头试虫注射1次。以上实验进行3次生物学重复。

1.6 RNAi后Br-Z2/3, caspase-9, reaper和Gadd45g的表达水平测定

1.5节RNAi处理组和阴性对照组于12和24 h后随机选取5头幼虫，利用总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)提取供试小菜蛾总RNA，利用全式金生物技术有限公司反转录试剂盒合成cDNA第1链。 根据NCBI中已登录的Br-Z2/3及其下游细胞凋亡基因caspase-9(GenBank登录号: KF030680.1),reaper(GenBank登录号: KF991219.1)和Gadd45g(GenBank登录号: MW160738)的核酸序列，用软件Primer5.0设计其qPCR引物，内参基因EF-1α(GenBank登录号: EF417849)定量引物参考符伟等(2012)(表1)。qPCR反应体系参照NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (近岸蛋白质科技有限公司)的说明书。反应程序: 94℃ 2 min; 94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环。每个处理或对照测定3个样品，每个样品3次技术重复。

1.7 RNAi后小菜蛾生物学指标观测

RNAi处理后，每6 h观察记录试虫死亡数、化蛹数、畸形蛹数，计算幼虫死亡率、化蛹率、平均化蛹时间、蛹畸形率等。死亡率=(死亡虫数/总试虫数)×100%;化蛹率=(化蛹数/试虫总数)×100%;畸形蛹率=(畸形蛹数/总化蛹数)×100%。

1.8 数据分析

基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)，独立样本T检验法检验处理与对照差异显著性，显著水平设定为P<0.05，运用SPSS 22.0完成。

2 结果

2.1 dsRNA表达载体的诱导表达

PCR扩增获得小菜蛾Br-Z2/3(图1: A)和GFP片段(图1: B)。将克隆的片段与克隆载体pEASY-Blunt连接转化，对pEASY-Blunt-Br-Z2/3及 pEASY-Blunt-GFP菌液PCR检测的结果也表明分别与预期片段基本相符(图1: C, D)，其测序结果与预期一致。

L4440-Br-Z2/3菌液PCR检测得到一条大小接近500 bp的条带(图1: E)，L4440-GFP菌液PCR检测得到一条大小接近350 bp的条带(图1: F)，与预期相符；L4440-Br-Z2/3重组质粒经双酶切后得到一条约2 700 bp和一条约500 bp的条带(图1: G)。L4440-GFP重组质粒经双酶切后得到一条约2 700 bp和一条约350 bp的条带(图1: H)，其结果与目的片段及线性L4440质粒片段大小一致，表明Br-Z2/3与GFP的dsRNA片段已构建至L4440载体上。测序结果也证实构建正确。

加入IPTG(1 mmol/L)后，于37℃诱导6 h，提取对照菌体总 RNA结果显示如图2。 L4440-Br-Z2/3菌株和L4440-GFP菌液均表达出与预期大小一致的dsRNA(箭头所示)，而未经 IPTG 诱导的 L4440-Br-Z2/3 菌液与L4440-GFP菌液均未表达出相应dsRNA，纯化后dsRNA浓度能够高达1 040 ng/μL。

图1 RNAi载体的构建

图2 dsBr-Z2/3 (A)和dsGFP (B)在细菌中表达的鉴定

图3 显微注射Br-Z2/3 dsRNA后小菜蛾4龄幼虫中Br-Z2/3, reaper, caspase-9和Gadd45g的表达量

2.2 Br-Z2/3基因RNAi后相关基因表达变化

qPCR检测结果显示，与阴性对照组比较，注射Br-Z2/3 dsRNA后12和24 h，Br-Z2/3相对表达量分别显著下降了66.75%和83.47%(图3: A)(P<0.05)；reaper相对表达量在12和24 h分别显著下降了17.52%和82.71%(图3: B)(P<0.05)；caspase-9相对表达量在12和24 h分别显著上升了40.35%和34.76%(图3: C)(P<0.05)；Gadd45g相对表达量在12和24 h分别显著上升了321.77%和362.99%(图3: D)(P<0.01)。

2.3 Br-Z2/3基因RNAi对小菜蛾化蛹的影响

注射Br-Z2/3 dsRNA后，处理组中试虫便开始发生死亡，直至48 h幼虫死亡率才稳定在40%，而对照中死亡率较低，30 h便稳定在6.67%(图4: C)；处理组中即便是存活个体也没有全部化蛹，实验结束时，处理组中化蛹率为46.67%(图4: B)，试虫存活率低于60%(图4: C)，而对照组中试虫化蛹率为93.33%(图4: B)，存活试虫全部化蛹(图4: C)；实验组中试虫化蛹也推迟，平均化蛹时间为50.13 h，显著长于对照组的34.64 h(P<0.05)(图4: A)；处理组成功化蛹的个体中还有相当数量的畸形蛹，畸形率达到56.67%(图4: D)，而对照组中蛹畸形率仅有6.67%(P<0.05)(图4: D)；畸形主要表现为预蛹不能成功蜕皮及个体偏小(图5)。

3 讨论

图4 显微注射Br-Z2/3 dsRNA到小菜蛾4龄幼虫后对小菜蛾平均化蛹时间(A)、化蛹率(B)、幼虫死亡率(C)和畸形蛹率(D)的影响

图5 小菜蛾4龄幼虫Br-Z2/3基因RNAi后畸形蛹

通过dsRNA沉默靶基因的表达是基因功能研究的重要方法。当前用于昆虫学研究中dsRNA合成主要有试剂盒体外转录以及原核表达两种。其中，dsRNA合成试剂盒价格较高，且合成 dsRNA 产出少、浓度低，而利用原核菌体表达的方法可低成本大量合成dsRNA(王雪庆等, 2018)。本研究中成功实现了Br-Z2/3 dsRNA的体外原核表达(图2)，dsRNA浓度能够高达1 040 ng/μL，较好满足了实验要求。而在dsRNA的递送方面，通常有饲喂法和注射法两种，对于体型较大个体一般都采用注射法。Huang等(2019)应用饲喂法研究Br-Z2/3 RNAi后试虫化蛹变化，发现连续饲喂dsRNA 72 h后，试虫Br-Z2/3基因的表达量也仅降低了40%，最终试虫化蛹率仍可达36%。而本研究采用显微注释法注射Br-Z2/3 dsRNA 12 h后，试虫Br-Z2/3的表达量便下降了66.75%，24 h更进一步降低了83.74%(图3: A, B)，可见相较于饲喂法，显微注射法见效更快、效果更好。

通常昆虫Br基因沉默与保幼激素类似物处理能表现相同的症状(Spokony and Restifo, 2007)。对小菜蛾而言，保幼激素类似物蚊蝇醚处理小菜蛾3龄末幼虫后，试虫死亡率升高、化蛹推迟、化蛹率下降(Duanetal., 2016)。本研究中Br-Z2/3 dsRNA显微注射法处理小菜蛾4龄幼虫，结果也都类似(图4)。此外，在赤拟谷盗Triboliumcastaneum研究中也发现，敲除其Br-Z1-Z4中任何一个异构体，导致试虫死亡增加的同时，也有畸形蛹的出现(Konopova and Jindra, 2008)。本研究中也发现显微注射Br-Z2/3 dsRNA后，部分试虫虽未死亡但是所化蛹却为畸形蛹(图5)。

虽然改用显微注射法后，RNAi效率显著提高，靶基因表达降低了83.74%，但是试虫最终化蛹率仍有近40%。其中可能有沉默效果仍不够彻底的原因，也可能与小菜蛾中另一个Br基因Br-Z7的存在有关。Br蛋白对全变态昆虫化蛹的启动机制是Br促进细胞凋亡因子基因reaper,hid,dronc和drice等的表达从而诱导幼虫相关组织的程序化死亡以及成虫盘的分化(Jiangetal., 2000; Cakourosetal., 2002; Riddifordetal., 2003)。因而当Br基因表达受到抑制，其下游细胞凋亡基因表达也会相应下降，这便是试虫reaper表达水平降低的原因(图3: B)。然而作为dronc同源基因的caspase-9及Gadd45g表达却显著增加(图3: C, D)，其中原因尚待进一步研究。

综上所述，本研究成功构建Br-Z2/3 dsRNA原核表达系统，并利用该系统合成的dsRNA通过显微注射递送小菜蛾4龄幼虫而成功抑制Br-Z2/3基因的表达。此外，本研究发现成功干扰Br-Z2/3后，小菜蛾幼虫死亡率显著上升，化蛹高峰期推迟并出现畸形蛹；而与Br-Z2/3基因相关联的reaper,caspase-9和Gadd45g的表达量也发生了显著变化(P<0.05)，说明Br-Z2/3基因作为蛹期特异表达因子能够显著影响小菜蛾的蛹期进程。