基于低场二维核磁共振的油茶籽油鉴别与掺兑检测

王 欣 傅利斌

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

0 引言

油茶籽油是中国的特色油脂之一，其原料产区主要分布于湖南、江西、广西等省份[1]。油茶籽油的脂肪酸组成与橄榄油极为相似，含有维生素E、甾醇、角鲨烯等多种抗氧化活性物质，具有预防心脑血管疾病等功效[2-4]。由于具有独特的风味和高营养价值，油茶籽油逐渐得到了消费者的认可。然而，不法商家为了攫取暴利而以其他植物油掺兑或直接假冒油茶籽油的现象时有发生[5-6]。因此，研究针对油茶籽油真伪及掺兑鉴别的检测方法具有重要意义。

作为一种新兴的快速、无损检测技术，低场核磁共振技术(Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)在油脂检测领域有很大的应用潜力。基于Laplace变换的低场时域核磁共振弛豫信息一般包括纵向弛豫时间T1(自旋-晶格)和横向弛豫时间T2(自旋-自旋)图谱两方面。文献[7]在大量分析不同温度和压力下的原油样品的T1数据的基础上，建立了T1与粘度间的相关性模型。T2除与油脂的粘度密切相关外[8]，也与食用油的脂肪酸组成及含量有关[9-10]，在食用油氧化过程中，T2弛豫信息与过氧化值、共轭二烯含量、总极性化合物含量等均存在良好的相关性[11-12]。目前，应用低场核磁横向弛豫时间T2的分析研究相对较多[13-14]，但一维低场核磁共振技术面对复杂样品所能获取的信息是有限的，同时较高的光谱重叠效应也会影响其检测能力[15]。实际上，低场二维核磁共振技术(LF-2D-NMR)可以提供更为丰富的信息[16]，LF-2D-NMR可以获取与分子运动特性(纵向弛豫时间T1、横向弛豫时间T2、扩散系数D等)有关的时域谱信息，并可以将其直观地反映为峰分布情况的变化。目前，LF-2D-NMR在石油勘探领域可用于表征水和油的分布情况[17]，在食品及果蔬的品质分析中则可用于确定含水率及储藏过程中的水分迁移情况[18-19]。在油脂掺兑方面，文献[20]使用一维和二维图谱对橄榄油、掺兑葵花籽油/红花籽油的橄榄油进行分类识别，发现二维图谱具有更好的分类识别效果。文献[21]利用低场T1-T2二维图谱特征信息实现了对4种食用油的分类识别。文献[22]研究发现，低场T1-T2二维图谱可用于表征食用油中不饱和脂肪酸的氧化。总体来看，LF-2D-NMR在食用油检测尤其是食用油鉴别及掺兑检测方面的应用效果仍有待进一步研究。

基于以上分析，本文以识别油茶籽油为目标，对多种正常及氧化状态的食用油的低场T1-T2二维核磁共振图谱特征进行采集，进而结合化学计量学方法，如PLS-DA(偏最小二乘判别分析)和PLS(偏最小二乘回归)，分别建立油茶籽油与其他植物油及氧化油脂的定性分类模型及掺兑油茶籽油的定量分析模型，为建立基于LF-2D-NMR技术的油茶籽油快速鉴别方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

油茶籽油(Camelia oil,CAO)、菜籽油(Rapseed oil,RAO)、花生油(Peanut oil,PEO)、稻米油(Rice oil,RIO)、玉米油(Corn oil,CO)、大豆油(Soybean oil,SO)、葵花籽油(Sunflower oil,SUO)、亚麻籽油(Linseed oil,LIO)购于上海市杨浦区沃尔玛商场。

冰乙酸(分析纯)、硫代硫酸钠(分析纯)、碘化钾(分析纯)、三氯甲烷(分析纯)、可溶性淀粉(分析纯)、无水碳酸钠(分析纯)购于上海国药化学集团有限公司。

油茶籽油二元掺兑油样：向油茶籽油中分别加入一定量的玉米油、大豆油或葵花籽油，最终得到3个系列掺兑量(其他植物油质量分数)为0、20%、40%、60%、80%、100%的二元混合样品(CAO+CO,CAO+SO,CAO+SUO)，充分混合后储藏于4℃冰箱备用。

氧化油样(Oxi-oil)：采用干燥箱加速氧化法[23]制备氧化油样，分别取8种植物油各500 mL于1 L烧杯中，在105℃干燥箱中敞口、避光氧化4 d，样品冷却至室温(20℃)后密封冷藏于4℃冰箱中备用。依据文献[24]进行样品过氧化值(Peroxide value, Pov)的测定，结果以g/(100 g)表示。采用Testo270型极性化合物检测仪进行总极性化合物(Total polar compounds,TPC)质量分数测定[25]。

油样的过氧化值及总极性化合物质量分数如表1所示。

表1 氧化油样的过氧化值与总极性化合物质量分数Tab.1 Pov and TPC of Oxi-oils

1.2 仪器与设备

PQ001-020-015V型LF-NMR仪(磁场强度0.5 T，脉冲频率20 MHz，苏州纽迈分析仪器股份有限公司)；XW-80A型微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；HH-S21型恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司)；Testo270型食用油品质检测仪(德国德图集团)；FA2204B型分析天平(上海越平科学仪器有限公司)；干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司)。

1.3 LF-2D-NMR检测条件

准确移取2.5 mL样品至直径为15 mm的核磁专用试管中，35℃恒温水浴20 min后在以下参数条件下检测：IR-CPMG序列，仪器温度35℃，采样频率(SW)250 kHz，重复采样等待时间(TW)3 000 ms，重复采样次数(NS)4，回波个数(NECH)5 000，半回波时间(DL2)1 ms，累加采样次数(NTI)20。

样品经检测后得到如图1a所示的原始衰减曲线，使用Matlab 2018软件对原始衰减信息文件进行Laplace变换反演，得到如图1b所示的T1-T2二维核磁共振图谱，颜色深浅表示信号量大小，色彩亮度越高则信号量越大，色彩亮度越低则信号量越小。图1c为T1-T2二维核磁图谱的3D视角图。使用Matlab 2018提取以下特征信息：总信号量TA、总像素数S、最大信号量C，T1的起始时间T1S及结束时间T1E、T2的起始时间T2S和结束时间T2E；当对T1-T2二维核磁图谱3D视角图在最大信号量为1/2处作水平横截则还可获得1/2峰高截面图(图1d)，从中可提取得到以下特征信息：截面处的T1起始时间T1SJ及结束时间T1EJ、截面处的T2起始时间T2SJ及结束时间T2EJ。

1.4 数据分析方法

应用SPSS 19.0的Duncan法进行显著性分析，应用Origin 8.0绘图；应用Matlab 2018进行原始数据反演。

(1)PLS-DA模型

(2)PLS模型

应用SIMCA 12.0，以样品的TA、S、C、T1S、T1E、T2S、T2E、T1EJ、T2SJ、T2EJ信息作为数据变量，使用帕累托缩放对数据进行归一化处理，通过偏最小二乘回归(Partial least squares, PLS)建立油茶籽油掺兑其他食用油的定量预测模型。以交叉验证均方根误差(RMSECV)和预测均方根误差(RMSEP)评估模型的准确性，以决定系数R2反映模型的线性拟合程度。当RMSECV最小时，确定模型最佳主成分个数。

(3)建模集与验证集设置

所有定性分类及定量预测模型均使用2/3的样本构建建模集模型，1/3的样本作为外部验证建立验证集模型。

2 结果与分析

2.1 正常食用油的LF-2D-NMR弛豫特征

2.1.1正常食用油的LF-2D-NMR图谱

图2为不同食用油的LF-2D-NMR图谱。由图2可知不同食用油的T1-T2分布位置、形态及大小。整体来看，各食用油的T1-T2二维核磁图谱均表现为椭圆型单峰，分布于图谱对角线上。且油脂种类不同，其T1-T2二维核磁图谱分布有所区别。相比之下，油茶籽油(CAO)在T1方向的分布较窄(30.22～659.02 ms)，而在T2方向的分布相对偏左，T2S为27.60 ms。菜籽油(RAO)、花生油(PEO)及玉米油(CO)的T1-T2分布相同，虽然大豆油(SO)与葵花籽油(SUO)的T1及T2起始时间相同，但SUO具有相对较大的T2E，故在T2方向上的分布更宽。稻米油(RIO)则在T1方向的分布上明显下移，其T1S为27.60 ms,T2方向上则明显左移，其T2S为19.21 ms；而亚麻籽油(LIO)的T1S为39.67 ms，明显上移，在T2方向上则明显右移，其T2S显著高于其他植物油，为36.23 ms。

食用油的T1-T2分布与其脂肪酸组成有一定关系。研究表明，RIO中的氧化甘油三酯聚合物(TGP)、游离脂肪酸(FFA)、甘油二酯类(DG)等极性化合物相对较高[30]，而极性化合物的增多会使体系的T2弛豫时间相对减小，这与RIO在T2方向上的左移相符[31]。在T1方向上，油脂粘度越大，其T1弛豫时间越小[32-33]，而RIO与SO在40℃时的粘度分别为38cP和32.7cP[34]，使得RIO的T1二维图谱峰在T1方向上明显下移。

进一步选取视角角度为X:2°—Y:23°分析CAO和LIO的低场二维核磁图谱3D视角图，如图2i与图2j所示，油茶籽油表现为单峰，而亚麻籽油则为明显的双峰特征。这是由于LIO富含亚麻酸，其不饱和脂肪酸比例显著高于油茶籽油，而不饱和脂肪酸中的双键的增多使得氢质子核磁响应的不均匀度增大，进而出现了新的弛豫峰[10]。

2.1.2正常食用油二维图谱特征

进一步提取8种食用油二维图谱特征，其中，总信号量TA、总像素数S及最大信号量C如表2所示。

表2 8种食用油二维图谱特征Tab.2 LF-2D-NMR spectrum information of edible oils

总信号量TA与样品中氢质子的数量以及所处状态有关。由表2可知，CAO的总信号量最大，为5 484.16±7.92，LIO总信号量最小，为5 225.78±17.64。RAO和PEO的总信号量无显著性差异，分别为5 459.01±3.64和5 448.62±1.01，而CO的总信号量相对减小。此外，相比之下，这些富含单不饱和脂肪酸(MUFA)的油类，即CAO、RAO、PEO、RIO，其总信号量均在5 400以上，明显大于以多不饱和脂肪酸(PUFA)为主的油类(CO、SO、SUO、LIO)。这可能是由于，随着食用油中脂肪酸不饱和度的增加，体系中总的氢质子量相对减少，样品的总信号量逐渐减小。

总像素数S是样品峰在二维图谱上所占的像素点的个数，可反映样品峰在图像上的面积。由表2可知，RIO总像素数高达703.50±1.22，明显高于其他食用油。其次为LIO(659.16±7.96),而油茶籽油的总像素数最小，仅为623.33±4.54。但RAO与PEO、SO与SUO的总像素数无显著差异。

最大信号量C是T1-T2二维核磁3D视角图中最高峰的顶点信号量。可以发现，MUFA类油脂的最大信号量在17.13～18.94之间，其中，CAO的最大信号量为18.94±0.06，而PUFA类油脂的最大信号量均低于17.00，其中，SUO的最大信号量最小，仅为15.87±0.04。

图3a、3c分别为8种食用油样品的弛豫峰及1/2峰高截面处的起始与结束时间的比较。由图3a可知，从T1方向来看，CAO、RAO、PEO、CO、SO、SUO等6种油样的T1SJ相同，均为62.41 ms，食用油在T1SJ上的差异度相对小于T1S；而在T2方向上，CAO与PEO的T2SJ均为52.06 ms，而RAO、CO、SO、SUO的T2SJ均为57.00 ms。RIO的T1SJ和T2SJ最小，分别为57.00、47.55 ms。LIO的T1SJ与T2SJ最大，分别为68.34、62.41 ms。由图3c可知，CAO的T1EJ与T2EJ均最小，分别为549.74 ms和383.54 ms。RAO与PEO的T1EJ相同(601.90 ms)，CO、SO的T1EJ相同(659.02 ms)，RIO、SUO、LIO的T1EJ分别为549.74、790.02、864.98 ms。8种食用油T1EJ的变化规律与T1E相同。对于T2EJ而言，除PEO与CO相同(502.10 ms)，其他6种食用油均不相同，且 PUFA型食用油(CO、SO、SUO、LIO)的T2EJ随不饱和度增加而增大。

8种食用油的T1SJ、T2SJ、T1EJ、T2EJ与对应的T1S、T2S、T1E、T2E有着整体相似的变化规律，但对于部分T1-T2分布相似的食用油，截面处信息又存在差异。例如，RAO、PEO、CO在图2a中的T1-T2分布虽然相似，但其T2SJ、T1EJ、T2EJ均有所区别。SO与SUO的T1-T2分布较为相似(图2a)，但由图3c可知，其T1EJ与T2EJ均存在差异，分别为659.02、549.74 ms和790.02、601.90 ms。因此1/2峰高截面处的起始与结束时间可以作为不同食用油低场二维核磁特征信息的有效补充。

2.1.3油茶籽油与食用油的PLS-DA分类模型

基于8种食用油的低场核磁共振二维图谱信息建立针对油茶籽油的PLS-DA分类模型，结果如图4(t1、t2分别表示主成分1和主成分2)所示。由图4a可知，8种食用油在PLS-DA得分图上可清晰区分。油茶籽油、菜籽油、花生油、稻米油等4种MUFA型油脂分布于得分图的右半区域，而以玉米油、大豆油、葵花籽油、亚麻籽油为代表的PUFA型油脂则分布于得分图的左半区域。油茶籽油位于得分图的第1象限，与其他油脂区分明显；稻米油则位于第4象限。亚麻籽油在得分图上位于第3象限，明显远离其他油样。此外，油脂的分布与脂肪酸组成有一定关联，随油脂脂肪酸不饱和度的增加，其在主成分t1方向上呈现从右往左的分布，规律良好。

此外，在PLS-DA模型中，变量的VIP值可以反映其在模型区分效果中的重要性，当VIP值大于1时，可以认为具有显著作用。由图4b可知，S、TA、T2E、T1E、T1EJ、T2EJ等6个变量的VIP值均大于1，具有显著性作用。结合图3可知，不同食用油T1、T2的结束时间与截面处结束时间的区别度相对较大，故在模型区分效果中的贡献度更高。

2.2 氧化食用油的LF-2D-NMR弛豫特征

2.2.1氧化食用油的LF-2D-NMR图谱

图5为8种氧化食用油的低场T1-T2二维核磁图谱。由图5可知，氧化油茶籽油(Oxi-CAO)的T1、T2分布分别为30.22～721.55 ms和25.21～549.71 ms，与图2a中正常油茶籽油的T1E、T2S相比，Oxi-CAO 在T1方向的分布变宽，而在T2方向上的分布相对左移。其他氧化食用油的T1S、T2S也发生不同程度的改变，例如，氧化玉米油(Oxi-CO)和氧化亚麻籽油(Oxi-LIO)的变化相对较大。玉米油氧化后，其T1S、T2S分别从正常状态的33.09、30.22 ms分别减小至23.03、9.30 ms，分布位置明显左移，且峰前部出现大量低信号量响应。由表1可知，Oxi-CO的总极性化合物质量分数高达36.5%，极性化合物的大量产生使样品中的氢质子弛豫速率增大，表现为T2减小，峰相对左移[11]。此外，Oxi-LIO的T1S、T2S分别从正常状态的39.67、36.23 ms减小至30.22、21.03 ms，分布位置也相对左移。这与亚麻籽油富含亚麻酸，脂肪酸不饱和度高，极易被氧化密切相关[35]。

与正常油样相比，除Oxi-CAO、Oxi-SO、Oxi-SUO的T2E保持不变外，其他几种氧化食用油的T2E均有所减小，结合T2S的变化可知氧化食用油在二维图谱上的T2分布都发生了不同程度的左移。Oxi-RAO、Oxi-PEO、Oxi-RIO、Oxi-CO、Oxi-SO的T1E均出现不同程度的减小，结合T1S的变化，其在二维图谱的T1方向的分布相对下移；而Oxi-CAO、Oxi-SUO与Oxi-LIO的T1E相对增大，即T1方向的分布变宽，这可能与氧化过程中生成的某些短链脂肪烃有关，较小的相对分子质量，分子间作用力较弱，使得质子自由度较大，弛豫时间变长[36]。

2.2.2氧化食用油二维图谱特征

8种氧化食用油二维图谱特征如表3所示。由表3可知，与正常油样相比，氧化油样总信号量TA均发生不同程度的下降，除氧化大豆油(Oxi-SO)、氧化葵花籽油(Oxi-SUO)外，其他6种氧化食用油总信号量下降幅度都在100左右。油脂在氧化过程中脂质分子失去氢离子生成自由基[37]，使得样品中整体氢质子数量下降，进而导致总信号量降低。

表3 氧化食用油二维图谱特征Tab.3 LF-2D-NMR spectrum information of Oxi-oils

同时，氧化油样总像素数S相对增大，其中，Oxi-CO的总像素数增多最为明显，从645.50±2.42增大至845.83±10.60。从二维谱图中也发现低信号量响应，表现为峰前端出现拖尾现象。如图5a所示，氧化亚麻籽油的峰前部出现大量颜色较浅、信号量较小的信号点，出现拖尾情况。

氧化油样最大信号量C均有所降低，Oxi-CAO最大信号量降至17.72。Oxi-COC降幅最大，减少了2.04，而其总信号量也表现为显著减小。

图3b、3d分别为8种氧化油样的弛豫峰及1/2峰高截面处的起始与结束时间的柱状图。观察发现，Oxi-CAO的T1SJ与T1EJ分别为57.00、502.10 ms，与正常CAO的T1SJ(62.41 ms)和T1EJ(458.58 ms)相比，Oxi-CAO截面处的T1分布变宽且左移，而截面处T2分布无变化。由图3b可知，Oxi-CO与Oxi-LIO的T1SJ、T2SJ分别为47.55、39.67 ms和57.00、52.06 ms，比正常CO(62.41、52.00 ms)与LIO(68.34、62.41 ms)明显缩短。由图3d可知，与正常油样相比，Oxi-RAO、Oxi-PEO、Oxi-RIO、Oxi-CO、Oxi-SO的T1EJ减小，而Oxi-CAO、Oxi-SUO、Oxi-LIO的T1EJ增大；Oxi-CAO、Oxi-SO、Oxi-SUO的T2EJ不变，其他几种氧化食用油的T2EJ则有所减小。8种氧化食用油在1/2峰高截面处的结束时间变化规律与弛豫峰结束时间的变化规律相同。

2.2.3油茶籽油与氧化食用油PLS-DA分类模型

为了鉴别油茶籽油与氧化油样，提取正常油茶籽油与8种氧化油样的二维图谱特征信息建立PLS-DA模型，结果如图6所示。

由图6a可知，正常油茶籽油与8种氧化油样在PLS-DA得分图上可清楚区分。正常油茶籽油、氧化油茶籽油/菜籽油/稻米油/花生油均分布于得分图的右半区域；氧化玉米油分布于得分图上部，远离其他油样；氧化大豆油/葵花籽油/亚麻籽油则分布于得分图的左半区域，其中氧化亚麻籽油单独位于得分图第2象限。从主成分t1方向看，正常油茶籽油位于最右端，其次是氧化油茶籽油，与正常油样的分布类似，随油脂脂肪酸不饱和度增加，氧化食用油呈现从右往左分布的规律。

2.3 油茶籽油掺兑其他油样的定量模型

为了定量预测CAO+CO、CAO+SO、CAO+SUO体系中非油茶籽油组分质量分数，分别建立PLS定量预测模型，各模型的回归系数如表4所示。

表4 油茶籽油二元掺兑PLS定量模型回归系数Tab.4 Coefficient of PLS models for adulterated camellia oils

表5 油茶籽油二元掺兑PLS定量模型效果Tab.5 Performance of PLS models

3 结束语

对不同种类食用油以及不同掺兑水平的油茶籽油调和油的低场T1-T2二维核磁图谱信息进行了研究，结果表明，油茶籽油、菜籽油、花生油、稻米油、玉米油、大豆油、葵花籽油、亚麻籽油的低场T1-T2二维核磁图谱信息存在差异，采用PLS-DA模型可对油茶籽油与其他7种食用油进行有效区分，模型判别正确率为100%；油茶籽油与氧化食用油在低场二维图谱上存在明显差异，且与7种氧化食用油(氧化菜籽油、氧化花生油、氧化稻米油、氧化玉米油、氧化大豆油、氧化葵花籽油、氧化亚麻籽油)的低场二维图谱信息也有显著区别，基于PLS-DA建立的油茶籽油与氧化食用油的模型判别正确率为100%；利用不同掺兑量的油茶籽油分别掺兑玉米油、大豆油、葵花籽油的二元混合样品的低场二维核磁图谱信息，建立油茶籽油二元掺兑PLS定量模型，模型拟合度优良，R2分别为0.988、0.962、0.941。本研究为利用LF-2D-NMR技术进行食用油种类鉴别及油茶籽油掺兑分析提供了依据。