2019年湖南省部分地区鸡、鸭、猪源大肠杆菌耐药性调查

唐标，陈怡飞，陈聪，王静鸽，黄磊，钱鸣蓉，杨华*

(1.浙江省农业科学院农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021；2.浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018；4.青海大学农牧学院，青海 西宁 810016)

大肠埃希菌俗称大肠杆菌，归属于肠杆菌科埃希菌属(Escherichia)[1-2]。大肠杆菌在自然界中广泛存在，是人畜肠道共栖菌和条件致病菌[3-4]，给畜禽养殖业造成严重的经济损失。近年来，随着抗生素在畜禽养殖中大量使用，导致了大肠杆菌的耐药谱较广且耐药率居高不下[5-6]。对我国江苏[7]、山东[8]、广东[9]、浙江[10]、四川[11]、黑龙江[12]等地区动物源大肠杆菌的调查发现，大肠杆菌耐药水平持续处于高位，多重耐药性问题日益凸显。多重耐药大肠杆菌不仅威胁畜禽健康，也可进入环境或通过食物链对人类健康构成威胁。

湖南省是我国的农业大省，也是畜禽养殖大省。为调查湖南省部分地区动物源大肠杆菌的耐药水平和耐药特征，本研究于2019年从湖南省部分养殖场中分离了203株动物源大肠杆菌，进行了药敏试验分析，以期为湖南省动物源细菌耐药性监测工作提供数据，同时为畜禽养殖过程中合理使用抗菌药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂及培养基

Mueller-Hinton肉汤(MHB)、LB琼脂、缓冲蛋白胨水(BPW)、麦康凯琼脂(MacConkey Agar)培养基和伊红美蓝(EMB)培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 标准菌株

大肠杆菌药敏试验质控菌株ATCC 25922为本实验室保藏。

1.3 药敏检测板

药敏检测板购自上海星佰生物技术有限公司，包含预制的具有固定稀释梯度的氨苄西林(AMP)、奥格门丁(阿莫西林/克拉维酸钾，A/C)、庆大霉素(GEM)、四环素(TET)、大观霉素(SPT)、氟苯尼考(FFC)、磺胺异噁唑(SF)、复方新诺明(SXT)、头孢噻呋(CEF)、头孢他啶(CAZ)、恩诺沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美罗培南(MEM)、安普霉素(APR)、黏菌素(CL)和乙酰甲喹(MEQ)等16种抗生素。

1.4 采样和分离方法

2019年10月从湖南省郴州市、常德市、宁乡市和株洲市的19个畜禽养殖场采集新鲜粪便样品，每个场采集新鲜粪便15份。采样场点包括减抗示范场5个和非减抗示范场14个，涉及鸡场14个、猪场3个、鸭场2个。

将粪便和肛拭子样品转接到BPW中，37 ℃增菌12 h，然后在麦康凯琼脂培养基上进行划线分离。37 ℃培养12 h，挑取可疑菌落(鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，边缘整齐)在EMB上再次划线验证，37 ℃培养12 h，挑取可疑菌落(金属绿色)至LB琼脂上进行划线，培养16 h后挑取单菌落进行细菌质谱鉴定。将验证确定的大肠杆菌菌株用20%甘油保藏至-80 ℃下备用。

1.5 接种菌悬液制备

将上述分离保藏的大肠杆菌在LB琼脂培养基上分离划线，纯化2次后，用接种环挑取5～10个单菌落至无菌生理盐水中，配制0.5麦氏浊度的悬浮液(约为1.5×108CFU/mL)；用MHB对菌悬液进行稀释，使得最终接种菌液浓度为5×105CFU/mL至10×105CFU/mL。

1.6 药物敏感性试验及结果判读

采用微量肉汤稀释法(微量孔板)检测16种抗生素对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)，依据美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute of America，CLSI)的相关药敏折点判定标准，判断菌株是否耐药，并且以敏感(S)、耐药(R)、中介(I)表示[13]。其中安普霉素和乙酰甲喹暂未有折点。大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株。

2 结果

2.1 大肠杆菌分离与药敏检测

从湖南省4市的19个畜禽养殖场分离大肠杆菌203个，每个场分离出菌株数1～15株，平均每个场10.7株。从鸡场、鸭场和猪场分别分离出的菌株数分别为146、20和37株大肠杆菌。

203株大肠杆菌对16种抗生素的药物敏感性检测结果如图1所示。根据测得的MIC分布规律来看，本研究中分离的菌株对大部分抗生素的耐药谱较宽，其中氨苄西林、四环素、磺胺异噁唑、复方新诺明等抗生素的MIC明显较高，表现出高度的耐药。相反，美罗培南、黏菌素的MIC则明显处于低位。所有受试菌株对氨苄西林和四环素的耐药率最高(图2)，均在80%以上；其次是磺胺异噁唑、复方新诺明和氟苯尼考，耐药率分别为74.9%、73.9%和67.0%。受试菌株对氨基糖苷类药物的耐药性在不同药物间存在较大差异，对大观霉素的耐药率较高(53.2%)，对庆大霉素的耐药率较低(19.7%)。203株大肠杆菌对头孢类药物的耐药率较低，对头孢他啶耐药率为2.5%，对奥格门丁的耐药率仅为2.0%。此外，对黏菌素的耐药率为0.5%，同时对美罗培南均敏感。通过此次的药敏结果可以发现，大肠杆菌的耐药性和抗生素的使用量相关性很强，对养殖中常用抗生素耐药率较高(四环素类、氟苯尼考、磺胺类)，而对禁用或处方治疗药耐药率极低(头孢噻呋、头孢他啶、奥格门丁、美罗培南、黏菌素)。

注：黄色代表耐药(R)，绿色代表中介(I)，蓝色代表敏感(S)；A～P分别为氨苄西林、奥格门丁、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、复方新诺明、头孢噻呋、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、美罗培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹图1 203株大肠杆菌对不同抗生素的最小抑菌浓度数量统计

图2 203株大肠杆菌的耐药率

2.2 不同养殖场来源的大肠杆菌耐药情况比较

从不同来源3种养殖动物中都分离出了大肠杆菌，见表1。鸡源大肠杆菌对四环素(87.7%)、氨苄西林(85.0%)、磺胺异噁唑(78.1%)、复方新诺明(75.3%)、氟苯尼考(67.1%)5种抗生素的耐药率超过50%。鸭源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高(90.0%)，其次是四环素(85.0%)、复方新诺明(85.0%)、氟苯尼考和磺胺异噁唑(均为65.0%)。猪源大肠杆菌对四环素的耐药率最高(97.3%)，随后是对氨苄西林(81.1%)、大观霉素(67.6%)、氟苯尼考(67.6%)、磺胺异噁唑(67.6%)和复方新诺明(62.2%)的耐药率较高(表1)。此外，鸡源大肠杆菌对头孢噻呋、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星4种抗生素的耐药率均高于鸭源和猪源。尽管不同动物源的大肠杆菌数目差异较大，但是一定程度反映了各个动物来源的菌株耐药性水平均处在高位。

表1 不同动物源大肠杆菌对14种抗生素的耐药率统计结果 /%

此次调查同时比较了减抗示范场和非减抗示范场来源的大肠杆菌耐药差异，见表2。分离的203株大肠杆菌中有52株来源于减抗示范养殖场，无论是减抗示范养殖场还是非减抗养殖场大肠杆菌分离株均对氨苄西林、四环素、磺胺异噁唑、复方新诺明和氟苯尼考表现出较高的耐药性(>60%)；减抗示范养殖场大肠杆菌分离株除对奥格门丁、美罗培南、黏菌素表现出全部敏感外，对其他药物均具有不同程度的耐药。此外，减抗示范养殖场大肠杆菌对氟苯尼考的耐药率显著高于非减抗示范养殖场，而对恩诺沙星的耐药率显著低于非减抗示范养殖场(P<0.05)，对于其余12种抗生素的耐药水平无显著差异。这个结果表明，减抗示范场的细菌耐药性相比其他养殖场并没有明显差异。

表2 不同类型养殖场分离的大肠杆菌对常用抗生素的耐药率

2.3 大肠杆菌多重耐药性分析

多重耐药性是评价细菌耐药性水平的另外一个指标。203株大肠杆菌对14种抗生素的多重耐药结果如图3所示。除11株大肠杆菌对所用药物全部敏感外，其余192株菌对至少一种药物耐药。178株菌(87.7%)对3种及以上的抗生素有耐药性，其中3～5种抗性有87株(42.9%)；6～9种有60株(29.6%)；9～11种有31株(15.3%)。203株大肠杆菌的耐药谱如表3所示。

表3 湖南省203株大肠杆菌的耐药谱

图3 203株大肠杆菌对14种抗生素的多重耐药分布

本研究中，203株大肠杆菌共有60种耐药谱型，优势耐药谱型为AMP-TET-FFC-SF-SXT和AMP-SPT-TET-SF-SX，分别占比9.4%和7.39%。有两株菌对11种药物耐药，谱型分别是AMP-A/C-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-ENR-OFL和AMP-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-CAZ-ENR-OFL。另外，有5.42%的菌株对14种药物均敏感。此次结果说明，大肠杆菌多重耐药比例很高，一定程度上反映出养殖场中细菌具有较高的耐药水平。

续表3

3 讨论

随着养殖业规模化、集约化的发展，使用抗生素作为饲料添加剂以预防和控制畜禽的细菌性疾病已经成为主要措施，然而抗生素的不合理使用和滥用导致了动物源耐药细菌大量出现[14-15]。本研究对湖南省203株大肠杆菌的耐药性监测结果显示：所有菌株对四环素、复方新诺明、磺胺异噁唑、氨苄西林、氟苯尼考等5种抗生素的耐药率，比对其他几种抗生素的耐药率高，这可能与这几种药物在畜禽养殖中大量使用有关[16]；对黏菌素的敏感率接近100%，这可能与黏菌素在2017年禁止作为饲料添加剂有关，呈逐年下降的趋势[17]。对于大部分抗生素，2019年湖南省大肠杆菌仍然呈高水平耐药。对氨苄西林的耐药率(84.7%)相比2016年湖南部分猪场(88.5%，52株)[18]稍低，四环素耐药率(89.2%)相比2013年湖南永州市(91.2%，91株)[19]和2009湖南西部地区(96.6%，147株)[20]的报道也有所降低。但是，动物源细菌耐药性数据来源较少，且缺少统一的监测方法、标准和药物范围，所以往往难以准确的比较耐药水平差异。

对分离自不同类型养殖场的菌株耐药性比较发现，除氟苯尼考和恩诺沙星外，减抗示范养殖场菌株对其余6种抗生素的耐药率数值上虽然低于非减抗养殖场菌株，但并没有统计学上的差异。这提示我们减抗示范养殖场需要做细菌耐药性水平评估，耐药性水平下降需要长期的过程。

质粒介导的获得性耐药基因丰富多样，可通过接合转移和转座子插入等方式水平转移至受体细菌，导致多重耐药现象传播。即使使用一种抗生素，也可能对多重耐药质粒具有选择压力，导致质粒长期存在，这无疑会对细菌耐药性的防控工作带来巨大阻碍。此次分离的动物源大肠杆菌的耐药谱以抗氨苄西林/四环素/氟苯尼考/磺胺异噁唑/复方新诺明为主，耐药谱类型达60种，下一步可以通过高通量测序探讨是否主要与质粒介导相关。此次研究提示，实际养殖过程中应减少上述抗生素的使用，避免长期使用同种或同类抗生素，尽量交替用药。另外，黏菌素作为饲料添加剂在2017年已被禁用，目前来看大肠杆菌对其耐药性下降效果明显，可为兽医临床治疗带来福祉。