基于新城疫病毒NP蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

贾妙妙，王国康，李 丽，王红琳，罗青平，邵华斌，曾 驰，温国元* (1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 43003；.湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所/农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/湖北省畜禽病原微生物学重点实验室，湖北 武汉，430064)

NP蛋白是含量最为丰富和保守性最高的病毒结构蛋白，其基因全长约为1.7 kb，开放阅读框长度1.47 kb，共编码489个氨基酸，相对分子质量为53 kDa。NP与L和P蛋白相互协作，调控病毒基因组的复制与转录[14]。NP蛋白的N端结合RNA，高度保守，其C端含有磷酸化位点和抗原决定簇位点。NP蛋白具有较强的免疫原性，但不具有免疫保护作用[15]。本研究采用原核表达系统，表达纯化NDV NP蛋白，以其为包被抗原，建立基于NP蛋白的NDV间接ELISA抗体检测方法，进一步分析其敏感性、特异性、重复性及其与HI检测方法的符合率，旨在为该方法的临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 毒株、血清和载体NDV LaSota株和6种禽类病原的阳性血清，包括NDV、H9亚型禽流感病毒(AIV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽大肠杆菌和沙门菌，均由本实验室保存。30份NDV阴性血清采集自1月龄SPF鸡。200份鸡血清样品采集自湖北、山东、河南和江苏省养殖场。原核表达宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)和表达质粒pET-30a购自德泰生物科技有限公司。

1.2 主要试剂病毒RNA提取、DNA回收和质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司；RT-PCR反应试剂、T4DNA连接酶和Taq DNA聚合酶购自宝生物工程有限公司；Ni-IDA琼脂糖凝胶购自德泰生物科技有限公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；HRP标记的羊抗鸡IgG购自北京索莱宝科技有限公司；酶标板购自康宁生命科学有限公司；其他试剂为进口或国产分析纯级。

1.3 NP蛋白的表达与纯化参照病毒RNA提取试剂盒的操作说明书，对感染NDV LaSota株的鸡胚尿囊液进行病毒RNA的提取，采用RT-PCR方法扩增获得NDV LaSota株的NP基因。将纯化的PCR产物通过酶切连接的方式连入pET-30a质粒中，经测序鉴定正确后，获得重组质粒pET-NP。

将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落置37℃培养，待其生长至对数期时加入0.2 mmol/L IPTG。置于15℃诱导表达16 h后，离心收集菌体。以蛋白重悬缓冲液重悬菌体沉淀，超声破碎。离心收集沉淀，加入8 mol/L尿素使其变性，采用Ni-IDA亲和层析法，对变性蛋白进行纯化并复性，TE缓冲液透析。以SDS-PAGE和Western blot方法对纯化蛋白进行鉴定。鉴定正确的NP蛋白以Bradford法定量后保存至-80℃。

1.4 NP蛋白的Western blot检测纯化的NP蛋白经SDS-PAGE后，电转至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂乳封闭2 h，加入NDV阳性血清(稀释度为1∶250)，4℃孵育过夜，PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗鸡IgG(1∶5 000)，37℃作用1 h，PBST洗涤3次，ECL化学发光法显色，并拍照记录分析。

1.5 NDV NP蛋白间接ELISA抗体检测方法将纯化的NP蛋白以包被缓冲液适当稀释，包被于酶标板中(100 μL/孔)，4℃过夜，PBST洗3次，3 min/次；加入封闭液(200 μL/孔)，37℃温育2 h，洗涤3次；用1%的脱脂乳稀释待检血清，加至酶标板(100 μL/孔)，37℃温育1 h，洗涤3次；加入1%脱脂乳稀释的HRP标记羊抗鸡IgG，37℃温育1 h，洗涤3次,加底物,加入TMB显色液(100 μL/孔)，避光37℃温育15 min后，加入终止液终止反应；以酶标仪测定各孔的D630值。

1.6 NDV NP蛋白间接ELISA反应条件的优化

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1.6.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 按方阵滴定法进行，用包被液将NP蛋白按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀释，每孔100 μL，4℃过夜；阳性血清和阴性血清分别作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200稀释，每孔100 μL，每孔重复3次，进行间接ELISA试验，测定每孔的D630值，计算相同稀释度的阳性血清和阴性血清孔之间D630值的比值(P/N值)，选择P/N值最大孔的稀释倍数作为最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度。

1.6.2包被条件的确定 将刚加入包被蛋白的酶标板分别置于37℃ 2 h、4℃过夜和37℃2 h+4℃过夜3种条件下作用，对NDV阴性、阳性血清进行ELISA检测，每个样品重复3次，测定各孔的D630值，比较P/N值，确定最佳包被条件。

1.6.3封闭液的确定 选用分别含有2%BSA、2%明胶和5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为封闭液，对NP蛋白进行稀释，并包被酶标板，进行NDV阴性和阳性血清的ELISA检测，比较P/N值，确定最佳封闭液。

1.6.4样品稀释液的确定 分别选用1×PBST和1%脱脂乳、1%BSA、2%脱脂乳、2%BSA、5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为样品稀释液，进行NDV阴性和阳性血清的ELISA检测，比较P/N值，确定最佳的样品稀释液。

1.6.5血清最佳结合时间的确定 对NDV阴性和阳性血清进行ELISA检测，血清温育时间分别为30、45、60和90 min，测定各孔D630值，比较P/N值，确定最佳血清温育时间。

1.6.6二抗最佳稀释度及孵育时间的确定 按方阵滴定法进行，对NDV阴性和阳性血清进行ELISA检测，二抗的稀释度分别为1∶2 500、1∶5 000、1∶7 500和1∶10 000，每个稀释度分别于37℃温育30、45和60 min，测定各孔D630值，比较P/N值，确定二抗最佳稀释度及温育时间。

1.6.7显色时间的确定 对NDV阴性和阳性血清进行ELISA检测，加入TMB显色液后，分别于37℃避光温育5,10和15 min，测定D630值，计算P/N值，确定底物最佳作用时间。

2 结果

2.1 NDV NP蛋白的表达与纯化以NDV LaSota株基因组RNA为模板，扩增获得了NP基因，将其插入到表达载体pET-30a。鉴定正确的重组质粒pET-NP转化至BL21(DE3)，以IPTG诱导表达后，进行包涵体的变性、亲和层析纯化、复性。对复性后的蛋白进行SDS-PAGE检测(图1)，只在约50 kDa处出现1条蛋白条带，与预期NP蛋白大小相符。进一步以Western blot方法对目的蛋白进行鉴定，以NDV阳性血清为一抗进行反应，同样在约50 kDa 处出现1条单一的反应条带(图2)。通过原核表达纯化的方法，成功获得了纯度较高的NP蛋白。采用Bradford法测得NP蛋白的质量浓度为0.54 g/L。

M.蛋白Marker；1.纯化NP蛋白

M.蛋白Marker；1.纯化NP蛋白

2.2 间接ELISA方法最佳反应条件的确定反应条件的优化结果为：NP蛋白包被质量浓度为0.675 mg/L，包被条件为4℃过夜，封闭液为含5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液，样品稀释液为5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液，被检血清稀释度为1∶200，血清温育时间为30 min，二抗稀释度为1∶2 500，二抗温育时间为60 min，显色时间为15 min。以确定的最优反应条件为参数，建立NDV间接ELISA抗体检测方法。

图3 30份NDV阴性血清的NDV间接ELISA检测

2.4 间接ELISA方法的特异性试验以建立的间接ELISA方法对H9亚型AIV、ALV-J、IBV、鸡大肠杆菌和沙门菌等5种禽类病原的阳性血清进行检测(表1)。结果显示，对5种阳性血清检测的D630值均小于0.164，未发生交叉反应。表明该间接ELISA检测方法具有良好的特异性。

表1 NDV间接ELISA方法的特异性试验

2.5 间接ELISA方法的敏感性试验将NDV阳性血清从1∶100开始，2倍梯度稀释至1∶25 600。将稀释后的阳性血清进行间接ELISA检测，同时通过HI试验测定该血清的HI效价(图4)。结果显示，NDV阳性血清检测为阳性的最低稀释倍数为1∶6 400，而通过HI试验测得该血清的HI效价为1∶128。表明检测ELISA方法的检测灵敏度为HI方法的50倍，具有较高的检测敏感性。

图4 NDV间接ELISA方法灵敏度检测结果

2.6 间接ELISA方法的重复性试验随机选取6份NDV阳性血清进行间接ELISA检测方法的组间重复性试验(表2)。结果显示4次组间重复试验的检测变异系数范围为1.65%～5.73%，均小于6.00%.表明该方法具有良好的检测重复性。

表2 NDV间接ELISA方法组间重复性试验

2.7 间接ELISA方法的临床样品检测对200份临床血清样本同时进行NDV间接ELISA抗体和HI抗体检测(表3)。结果显示，间接ELISA检测的阳性数为196份，HI检测的阳性数为190份。与HI方法相比，间接ELISA方法的符合率为97%(190+4=194,194/196=97%)，检测敏感性为100%(190/190=100%)，检测特异性为40%(4/10=40%)。

表3 NDV间接ELISA方法和HI方法的临床样品检测符合率

3 讨论

目前，已有的 NDV ELISA抗体检测方法主要是以灭活的NDV全病毒、原核表达的HN蛋白和HN特异性多肽为固相包被物[16-18]。灭活全病毒的制备成本低、且易于纯化，但其具有大量的抗原决定簇，可能会与禽血清中的非特异性抗体发生反应，出现假阳性。HN蛋白具有较强的构象依赖性，其原核表达产物会影响到其免疫反应性，进而影响检测方法的灵敏度[19]。P蛋白是6种蛋白中变化最大的一种，因此以其为包被抗原的ELISA可能具有较低的特异性[20]。在NDV的6个结构蛋白中，NP蛋白是含量最高和最为保守的，同时也具有较强的免疫原性[21]。因此，该蛋白可作为NDV间接ELISA抗体检测方法的优选包被蛋白。

本研究采用原核表达纯化的方式，获得了纯化的NDV LaSota株NP蛋白。试验中表达的NP蛋白大部分以包涵体形式存在，可能是由于蛋白表达量过高，其分子间的作用力增强，聚合趋向增大，形成聚合体，产生不溶性的蛋白沉淀，即包涵体。通过尿素变性、复性的方法，成功获得了可溶性的NP蛋白，且纯度较高。研究表明，以大肠杆菌表达的蛋白作为抗原检测血清抗体，容易出现假阳性、阳性样品吸光值偏高等问题，其主要原因是纯化蛋白中存在大肠杆菌菌体成分污染，其与被检血清中非特异性的大肠杆菌抗体发生反应。对包括大肠杆菌在内的5种其他禽类病原的阳性血清进行NDV间接ELISA方法检测，未发生交叉反应，表明NP蛋白的纯度较高，以其为包被蛋白建立的ELISA方法特异性良好。

HI方法是目前临床使用较为普遍的NDV抗体检测方法[22]。与HI方法相比，本研究建立的NDV间接ELISA检测方法敏感性是HI方法的50倍。对200份临床血清样品进行检测，二者的检测符合率为97%，检测敏感性为100%，而检测特异性仅为40%(4/10)。其原因可能与ELISA方法的敏感性高有关，后续需要检测更多的阴性样品，以进一步验证其检测特异性。

综上所述，本研究通过原核表达纯化的方法，获得纯化的NDV NP蛋白，以其为包被蛋白，通过检测条件的优化，建立NDV间接ELISA抗体检测方法。该方法具有良好的检测敏感性、特异性和重复性。临床样品检测结果表明，该方法与HI方法具有较高的检测符合率，可应用于临床血清样品的NDV抗体检测。