人乳头状瘤病毒（HPV）基因整合与宫颈病变

袁书凝，钱程，邢燕

（南京医科大学第一附属医院妇科，南京 210029）

1 概述

宫颈癌目前是全球女性第四常见的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，结直肠癌，肺癌[1,2]。 高危性人乳头状瘤病毒（high risk human papillomavirus，hr‐HPV）感染被认为是宫颈癌发病的一个主要原因，HPV16与18是美国最常见的hr‐HPV感染亚型，而HPV16与52是中国最常见的hr‐HPV感染亚型[3]。近年来，随着细胞学、HPV筛查的普及，宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的早期发现率、早期诊断率和早期治疗率均得到了极大提高，但是宫颈癌的发生率与死亡率仍然在上升[4]。大部分女性在一生中都会感染HPV，然而只有0.35%左右的HPV感染患者最终会转变为宫颈癌。HPV感染初期，其基因组在细胞核染色体外复制，是一种游离的基因复制方式[5]。Groves 等[6]在高达85%的宫颈鳞状细胞癌中发现，hr‐HPV DNA可以整合进入宿主细胞染色体即hr‐HPV的基因整合，使“一过性感染”变为“持续性感染”，是启动宫颈癌发生的一个必要非充分事件。同时，有研究发现[7‐9]，HPV的整合只出现在高级别宫颈病变中，随着宫颈病变程度加重，HPV 基因组整合率也在逐渐增高，这提示HPV 基因组整合率可能是宫颈癌发生发展过程中的重要标志物之一。hr‐HPV的整合成为宫颈病变早期诊断和精准治疗的热点。但是，目前对于HPV基因整合的分子生物学机制和整合位点等问题仍然不十分清楚，因此，本文将对HPV基因整合的具体机制、与宫颈病变程度的关系，及其临床意义进行简要的综述。

2 HPV的结构和整合机制

HPV病毒，是一个双链DNA结构，其中，结构域中的E6蛋白和E7蛋白对于肿瘤的发生有着重要的调控作用，即分别抑制p53和pRb功能，阻断细胞凋亡，使细胞周期失控。以微同源序列为代表的一系列学说为我们提供了HPV整合的可能机制。HPV整合后的致癌机制，目前的研究认为HPV E1、E2蛋白的缺失和结合部位甲基化导致的破坏，导致局部基因的不稳定，启动癌症的发生。其次，病毒‐宿主结合转录体的结构更加稳定；HPV整合形成一个病毒‐细胞超级增强子，启动高水平原癌基因表达；在HPV病毒整合之后可以破坏或更改细胞内基因和/或他们的侧翼序列的表达。

2.1HPV的结构

HPV病毒是一个封闭环状的双链DNA结构，由早期编码区域、晚期编码区域、非编码区3部分组成。早期编码区域产物为E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7蛋白，晚期编码区域产物为衣壳蛋白与次要衣壳蛋白（L1、L2），非编码区是病毒调节区域长控制区（LCR），起增强子的作用。其中，L1和L2作为衣壳蛋白，有免疫原性，E1和E2蛋白负责病毒基因组复制、转录调控，E4蛋白诱导细胞角蛋白网络的崩塌，E5蛋白可参与感染病毒抗原的递呈，是HPV建立持续性感染的重要因素之一，E6蛋白与E7蛋白联合发挥作用，抑制p53功能，从而阻断细胞凋亡，E7蛋白通过组织pRB使细胞周期失控[10,11]。

2.2 HPV的整合机制

关于HPV的可能整合机制仍然众说纷纭，目前学界较为接受的观点：HPV是随机整合入宿主的DNA序列，激活DNA损伤反应，驱动原癌基因E6/E7的高表达。有许多研究发现，HPV整合整合机制涉及多种可能机制，其中包括：氧化应激学说、环路理论、hr‐HPV整合体理论、微同源序列学说、超级增强子学说等。但是，其是否和疾病的不同阶段有关，或者存在联合整合机制，仍然需要进一步的研究探索。

2.2.1 氧化应激学说

病理生理学方面，高水平的活性氧导致DNA 、RNA、蛋白质、脂质损伤，从而导致细胞损伤，启动癌症[12]。HPV整合对于细胞生命来说，是一个终末事件。越来越多的研究证实，HPV整合机制很有可能是以激活DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）的方式发生，并与HPV的复制过程密切相关[13]。由于介导DNA修复的酶和参与DNA复制的酶之间是有重叠的，包括HPV在内的一些DNA病毒均已经被证明可以通过激活和利用DNA修复机制来增强自身的复制。HPV病毒的DNA复制过程发生在细胞核中，E1和E2复制蛋白的表达可以形成复制灶，招募DDR的成分，HPV进入细胞核并在核域10（ND10）体附近启动复制和转录程序，而核域10与DNA损伤区域相关。我们认为HPV整合开始于氧化应激导致的DNA损伤或者双链断裂，由病毒和环境因素介导的慢性氧化应激导致DNA损伤，从而增加HPV整合入基因组的频率。接下来的步骤由DNA损伤应答所驱动。Wongworawat等人[14]的研究表明，HPV 16的E6异构体即 E6*能够提高活性氧水平；氧化应激学说及慢性炎症已被证明在宫颈病变过程中刺激病毒整合和病毒原癌基因失调中发挥着重要作用。由此可见，未来的研究应致力于预防和逆转HPV整合。DNA损伤应答，敲除HPV整合序列，siRNA方法，修饰细胞选择整合基因组和表观修饰机制将是日后的干预方法。

2.2.2 环路理论

近来，Akagi等人[15]的研究针对HPV整合通路提出了一个“环路”的理论，即HPV整合介导的DNA复制和重组，可能会形成宿主‐病毒DNA串联体，破坏参与致癌作用和/或扩增E6/E7的基因。串联体是由宿主和病毒基因组序列组成，以相同的HPV断点序列相连，可能是因为病毒复制造成的DNA复制导致的。这样的“环路”模型也许是因为宿主‐病毒DNA串联体可以通过连接带切口的位点，桥接非连续性基因组序列。接下来，扩增链的游离末端可以与非连续序列联合、修复，以重复、相同的断点形成的串联线性结构，导致染色体内复制与重排。同时，环路结构与染色体重排是异常HPV整合体的副产物。

2.2.3 hr‐HPV整合体理论

Coleman等[16]的研究示转录沉默的hr‐HPV整合体是宫颈癌的一个重要中间阶段，与受感染细胞中游离体共存。游离体起源的E2蛋白抑制整合体转录，游离体的清除与整合体沉默的减少和整合体的选择有关。整合和整合体的克隆选择可以认为是两个独立的事件，整合的HPV因为代表病毒的一种形式，对宿主病毒清除机制有免疫作用，导致感染细胞维持细胞原癌基因高表达和避免细胞死亡，可以被看作是可选择的。

1/3的宫颈癌HPV整合体与区域性拷贝数变异（copy number variations，CNV）相联系[17]。最初的整合起自病变扩增基底细胞病毒和宿主DNA相邻的序列，HPV操纵宿主DNA的损伤应答，将病毒基因组融入宿主切口染色体，在细胞周期的特定阶段复制自己的DNA[18]，而且，目标区域一定是在宿主核染色质的转录区域，可以提供病毒原癌基因的表达[8]。

2.2.4 微同源序列学说

在整合断点研究基因组的测序发现了在人类基因组与HPV基因组基因组中的微同源序列区域。由此可见，微同源序列介导的DNA修复通路，在AT富集区域能够组成茎环结构，例如复制叉停顿、模版转换（Fork Stalling and Template Switching, FoSTeS）、微同源介导的断裂诱导复制(microhomology‐mediated break‐induced replication, MMBIR)[8]。通过比对宿主‐病毒DNA序列，我们发现3种方式，包括重叠，插入一些无序的核苷酸和直接连接。其中，重叠是最常见的一种方式，即细胞和病毒的序列有一些相同核苷酸[19]。HPV和人类基因组的微同源序列在整合位点附近富集，说明病毒和人类基因组的融合可能发生在微同源介导的DNA修复通路。这一现象表明微同源（MH）介导的 DNA修复通路参与整合。在HPV病毒感染中，局部基因结构变得不稳定，容易形成DNA碎裂或者是复制叉停顿，导致FoSTeS或者MMBIR通路的发生。之后，HPV会挟持MH‐介导的DNA修复通路,使自身与破碎的宿主基因组融合，完成整合过程[8]。

2.2.5 超级增强子学说

病毒的基因整合可以分为3类：I类整合是单个病毒基因组整合入宿主DNA；II类整合是数个重复的病毒基因组串联整合入一个单个位点，但中间无插入的宿主序列；III类整合，即是病毒‐宿主的插入共扩增式整合，在HPV相关的恶性肿瘤非常常见，是临近细胞序列常会发生共扩增和重排。核染色质编码病毒增强子和相邻扩增细胞序列富集于超级增强子标志物H3K27ac和Brd4。HPV16整合体生成一个由病毒上游调控序列（URR）和细胞增强子串联组成的超级增强子类的成分，二者协同，驱动原癌基因E6/7的高表达。我们推测有转录活性的机制增强子，在合适条件下都可以被扩增成为超级增强子[20]。这一超级增强子导致基因的选择性表达，从而导致原癌基因的高表达和肿瘤进展。

2.3 HPV整合后可能的致癌机制

HPV的整合启动癌症发生可能有如下几个机制：①E2蛋白的缺失以及E2蛋白结合部位的甲基化导致的破坏[21]，这两者同时取消了E2蛋白介导的E6与E7蛋白启动子的转录抑制，从而使E6、E7表达异常，导致重要细胞周期检查点的失活，驱动癌症的发生。E6与E7作为原癌基因，联合发挥作用，分别抑制p53和pRb功能。病毒原癌基因E6的产物抑制p53和BAK蛋白，及IRF‐3等一些细胞因子，从而降低INF‐b和PDZ的转录，同时其水平与端粒酶和MAPK通路正相关，使细胞扩增，促进细胞永生化；E7主要抑制pRb，pRb是p16的抑制剂，pRb的失活导致p16水平的上升，促使细胞增殖，导致癌变。②病毒‐宿主结合转录体的形成，复合E6/E7转录体较病毒E6/E7转录体更稳定[22]。③E1蛋白的缺失导致其复制活动的终止，造成DNA损伤，在E1和/或E2区域被破坏的情况下，这些复制蛋白不会从整合的基因组中表达，但会从共同复制的、染色体外的HPV基因组中表达，启动局部基因的不稳定性[16]，促进癌变。④HPV病毒在宫颈癌细胞中有转录活性，大部分的病毒转录方向与病毒基因一致，82%的mRNA序列示病毒基因在宿主基因的下游。整合区域的转录活性较未整合区域高。整合导致HPV上游调控序列（upstream regulatory sequence，URR）转录因子的募集和通读转录，使病毒‐宿主mRNA转录和病毒整合位点下游的表达小幅增加。HPV整合操纵和多聚化细胞增强子，从而产生一个病毒‐细胞超级增强子，启动高水平原癌基因表达。HPV基因组或调节因素的串联重复，内部拷贝存在转录性的基因沉默，有利于HPV基因整合后的选择性表达，有时有活性的基因组的串联序列能作为一个转录超级增强子，导致病毒逃逸，肿瘤进展和避免感染细胞死亡[20]。⑤在发生整合位置的附近与癌症有关基因的水平改变，HPV病毒整合之后可以破坏或更改细胞内基因和/或他们的侧翼序列的表达[21]，整合后的HPV整合点附近的基因水平较未整合处表达更高[23]，以致启动癌症的发生[18]。

3 HPV整合状态的检测方法及整合位点

HPV的病毒整合通常发生在致癌基因、普通脆性位点（common fragile sites, CFSs）附近、CpG区域附近及转录活性区。HPV的整合状态通常由荧光原位杂交、Southern印迹杂交、DIPS‐PCR技术、多重实时荧光PCR法、乳头瘤病毒致癌基因转录子扩增法（Amplification of Papillomavirus Oncogene Transcripts，APOT)、E2/E6比值等来测量。基于以上传统的基因测序方法，马丁等人发现了整合位点存在于POU5F1B，FHIT，KLF12，KLF5，LRP1B，LEPREL1[8]。然而，以上测序方法存在着时间长、所需样本多、敏感性低，费时费力，在扩增HPV方面效果不佳，且成本高昂等缺点。

新型基因测序方法，例如全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）以及高通量病毒整合检测（high‐throughout viral input detection，HIVID）是现今常用的两种方法来检测HPV整合位点的常用手段[24]。HIVID相较于WGS而言对序列的检测更加精确，它能先测量原癌基因的表达水平，同时测定整合位点与HPV病毒状态。全基因组测序表明HPV整合体通过侧面连接和桥接大量宿主基因扩增和重排，包括基因删除、倒置、染色体倒位、染色体易位和染色体内重排。基于HIVID方法，马丁等的研究发现了整合位点存在于POU5F1B、FHIT、KLF12、KLF5、LRP1B、LEPREL1，包括新的整合热点位置，例如HMGA2、DLG2和SEMA3D[8]。FHIT和LRPIB蛋白表达的下降与内含子HPV整合有关，而MYC与HMGA2表达的上升与相邻正常组织中HPV整合有关。MYC是编码一种能影响细胞周期生长，自然死亡，细胞转化的蛋白质。HPV捕获和二代测序法联合对于检测HPV亚型有很高的特异性和灵敏度，检测HPV的整合率，更进一步的检测病毒和细胞连接的序列。 TaME‐seq是扩增HPV中一个很有效的手段，能使测序成本大大下降。它能同步测试HPV基因组变异率和整合序列分析，它对序列的的广覆盖率能够发现较少见的变异和整合位点[25]。ViFi（Viral Integration and Fushion Identification）是一种新型技术，可以检测从WGS获得的整合位点和RNA序列数据中获得的人类‐病毒复合物mRNA。近期研究表明miRNA在HPV相关恶性肿瘤中，HPV的阳性、阴性与miRNA的表达水平密切相关。一个理论是整合的HPV产生的转录复合体可能吸收部分miRNA，另一种可能是转录复合体能更好的破坏宿主细胞通路[26]。

此外，在HeLa细胞系和宫颈癌标本中，HPV整合位点和相邻宿主基因组结构变异有很大的关联[8]。HPV整合位点与染色体易位处相邻，HPV插入与染色体易位的距离超过1Mb。HPV插入点与拷贝数变异（copy number variation，CNV）相邻，在某些病例中，HPV插入位点较病毒拷贝数要少。这一矛盾可能是因为病毒整合体和临近基因组序列的扩增，导致了多余的、相同的位点。HPV整合在DNA、RNA样本中存在着很大的差异，FHIT，KLF5和LINC00392是DNA样本中常见的整合位点，RAD51B, CASC8,CASC21, ERBB2, TP63, TEX41, RAP2B, 和MYC是RNA样本中常见的整合位点[15]。DNA样本中断点基因更易倾向于存在于内含子和启动子区域，在胆碱能突触通路进行富集，而RNA样本中断点基因更易倾向于存在于外显子，富集于癌症转录失调、黏着连接的通路中[27]。某些染色体区段被发现在整合过程中发生富集，染色体3、2、8、1是发生整合最常见的位点，例如3q28、2q22.3、3p14.2、8q24.21、13q22.1、14q24.1、17p11.1、17q23.1和17q23.2等。相比之下，HPV18感染更易导致整合，HPV18感染导致的宫颈病变更易在MYC基因存在的8q24.21发生整合[11]。HPV整合中，样本中断点基因的平均数和整合率一样，都与疾病进展正相关。断点基因可以发生在病毒基因组的任何位置，更倾向于发生在E1基因而不是E2基因，LCR区域较少。

4 HPV整合与宫颈病变的发生发展密切相关

通过宫颈上皮细胞的微损伤感染，HPV病毒颗粒进入并播散至宫颈上皮基底层，HPV从衣壳中释放，进入细胞核，即成为游离基因。HPV在感染宫颈上皮细胞后存在三种存在形式，包括游离型、整合型以及混合型。HPV处于整合状态时能在体内存在较长一段时间，使之不易被宿主免疫系统发现，成为“持续性感染”，在高级别上皮内瘤变及宫颈癌中更常见。随着宫颈病变程度的加重，整合型的比率逐渐增加，游离型比率逐渐降低，特别是在宫颈癌中，多重整合占大多数；在宫颈炎症和CIN中，以单一整合为主[6,9,28]。但是，HPV整合状态与宫颈病变进展相关性仍有待研究，有报道显示HPV整合发生在宫颈病变的起始阶段（如CIN I），混合型较完全整合型更有可能预示着疾病进展。而与腺癌相比，鳞癌有着更多的HPV整合率。HPV整合在受感染的细胞中提供了一个选择性生长优势，与治疗失败与缩短的无病生存率相关[7,29,30]。Joo 等人对204位宫颈癌接受化疗的患者利用原位杂交与PCR方法进行检测HPV整合状态及预后情况，他们发现：HPV整合是一个预测宫颈癌后无病生存期的生物标志物[29]。由此可见，HPV的整合状态可以被看作疾病进展的标志之一。

在HPV分型方面，HPV16、18、45相较HPV31、33而言有更多的整合潜能，从而更易引发高级别病变进展为宫颈癌[31]。HPV16常整合入2p23.2的基因间区域，穿插25kb的扩增相邻细胞DNA。有研究表明[32‐36]，HPV16的高病毒载量预示成为CIN2/3或宫颈癌的风险更高，更短的复发平均间隔时间和更低的总体生存率。拥有游离HPV形式的病人相对来说有最高的生存率和复发平均间隔时间。接下来预后由好至坏是混合HPV形式，HPV‐，整合HPV形式的病人[37]。已有研究发现，HPV16、58、33是中国西北部最常见的整合亚型[3]。

HPV整合作为疾病进展的标志事件之一，已经被用于临床诊断及治疗。在诊断方面，超过4个的HPV16整合位点宫颈癌病例后来都被诊断为III期宫颈癌，表明HPV整合与晚期宫颈癌是相联系的。有研究建议[37]，对有hr‐HPV感染，HPV整合但是TCT阴性的病人，常规阴道镜的实施也是必要的，以此来防止误诊的发生；对有hr‐HPV感染，HPV整合，宫颈活检为CIN I的病人，常规建议LEEP或者宫颈环切；对有hr‐HPV感染，而HPV整合检测及细胞学检查均为阴性的病人，建议短期观察。HPV整合位点的发现为HPV精准治疗提供了方向，hr‐HPV E6 E7 mRNA的检测可以发现非镜下病变的HPV整合[38]，但其对临床工作的意义仍停留在在理论层面。在治疗方面，HPV‐的宫颈癌亚型对放疗的反应最差，其假说可能是TP53基因在50%的宫颈癌案例中都有突变，导致了他们更有侵略性。另外，手术前使用放疗和化疗对于宫颈癌中HPV整合率的降低有一定影响。宫颈病变病毒表位的表达可能会拥有免疫原性，给精准治疗提供了方向，例如免疫检查点抑制剂——CTLA4或PD1抑制剂治疗[39]。尽管外科手术及放疗技术的进步，仍然有高达50%的局部进展性宫颈癌都会在治疗后2年内复发[40]，此时，补救性二次手术及二次放疗的选择变得十分局限。分子个性化治疗和预测性生物标志物能够改善患者预后，减小细胞毒性，使非选择性和靶向治疗的患者获益，从而达到精准治疗的目标。

5 小结

综上所述，hr‐HPV的整合与宫颈病变息息相关。HPV通过氧化应激、环路结构、形成hr‐HPV整合体、微同源序列、超级增强子等机制进行整合。通过E6、E7蛋白表达的异常调节，导致重要细胞周期检查点的失活和宿主内基因不稳定性的提高，从而驱动癌症的发生。新的检测技术可能会为给我们带来HPV整合的新位点。HPV整合状态可以被看作一个疾病进展的标志，同时也是一个预测宫颈癌预后的生物标志物。由此，HPV整合状态未来将被广泛用于宫颈病变的早期诊断和精准治疗。然而，目前关于HPV基因整合的研究大多基于细胞系分析，并不能代表宫颈癌的自然史。此外，目前关于HPV整合的研究大多是基于发病率最高的HPV16和18型，而对于其他的hr‐HPV并没有足够的数据证实。各种HPV的整合是如何参与宫颈病变的不同阶段，何种HPV在疾病发展仍能维持游离状态，哪种类型更易发生整合，各种HPV感染是如何相互作用的，HPV整合对于宫颈癌的发生是否是必要的都有待进一步深入研究。整合位点的发现、相关通路的研究对于宫颈癌的精准治疗和预后的判断有着重大的意义。利用新型测序和分子生物学方法有助于实现对宫颈病变和宫颈癌的个体化精准治疗。