细胞冷冻保存研究进展

龚 俊

（重庆大学生物工程学院,重庆 400044）

目前，随着生存环境恶化及生活压力加大，女性卵巢癌、宫颈癌等患者数量不断增加，男性也有一些弱精患者，针对这些患者，尤其是早期癌症患者，治愈后仍有生育需求，保存其生育能力不失为一种好的选择，细胞冻存技术就发挥了重要作用[1]。细胞低温冻存是指将细胞置于零下超低温，使其进入“休眠”状态，从而达到长期保存细胞的目的。低温能大幅降低细胞的新陈代谢速率，所以在液氮温度下细胞可以安全地长久保存，保存年限更是可以长达数十年。综上，超低温冻存技术是目前为止细胞长期保存最可靠且有效的技术。因此细胞低温保存技术在细胞移植和基因治疗等领域具有较强应用前景。

1 细胞冷冻保存

1.1 细胞冷冻原理

低温能抑制细胞体内所有的生化活动，从而使生物体内的生化反应速率降低、延长其生物活性时间。因此可以利用这一特性长时间保存生物体。一切由酶介导的生物体内新陈代谢过程中的化学变化，均服从一些共同的生化规律。瑞典科学家S.A.Arrhenius通过研究温度对化学反应速度的影响，得到了关系式 ：许多酶反应速率等试验也验证了这一关系式的正确性[2]。将活化能Ea常规范围内的数值代入该式，可推出化学反应速率随温度的降低而不断变小，同时也能推出生物变质速率与温度成反比的关系[3]。

1.2 低温损伤原理

常温条件下，细胞内、外的温度和浓度均一致，处于等温（温度）等渗(渗透压)状态，而渗透性和质膜特性对于大多数细胞低温保存的成功与否起着决定作用[4]。根据热传递原理，冷却过程中，细胞外的溶液先被冷却到其凝固点以下。对含水量较高的溶液，析出的固相几乎是纯冰，从而使胞外溶液浓度升高。因此，细胞内外就存在着温度差和浓度差，它们分别是传热和传质的驱动力[5]。

对于体积小、表面积却很大的细胞而言，细胞膜的水渗透率很高。细胞在温度不够低且高浓度的溶液中经历的时间过长，将导致细胞的损伤以至死亡，这种损伤被称为“溶液损伤”（“溶质损伤”）。此外，胞内冰的形成和再结晶也会对细胞膜造成一定程度的损伤或死亡，这种损伤被称为“胞内冰损伤”[6]。

1.3 细胞冷冻保存方法

机体的生化活性在低温环境下被抑制，从而降低细胞总体活性并钝化机体新陈代谢速率，最终达到长期储存生物样品的目的。但低温本身对机体也有损伤，因此在利用低温冻存细胞时，需先了解细胞在低温环境中的理化性质，也应当选择合适的冻存保护剂和冻存方式[7]。

1.3.1 慢速冷冻法

目前，传统的慢速程序化冷冻法正广泛应用于细胞保存中。其原理是以低浓度的冷冻保护剂为辅助，在程序化冷冻仪的控制下逐渐降温，使得冷冻保护剂在细胞充分脱水过程中，进入细胞，从而阻止胞内冰晶产生，保护细胞。目前大多慢速程序化冷冻都沿用1998年Oktay等提出的经典方案[8]，或在此经典方案的基础上改进。其优点为能较好地保存细胞，复苏后不影响细胞功能。但该方法需要的冷冻仪器昂贵且操作复杂、费时，因此开展难度大。研究人员正在积极寻找更为高效便捷的方式取代它。

1.3.2 玻璃化冷冻法

玻璃化冷冻法又叫快速冷冻法，其原理为溶液的固化，使用的高浓度冷冻保护剂经快速降温由液态直接转化为无结晶的玻璃化状态。这种方法能有效减少胞内外冰晶的产生，故更适合冷冻结构较为复杂的组织，如卵巢等[9]。随着玻璃化冷冻技术的一步步优化，1985年Rall等率先成功运用玻璃化冷冻法对小鼠胚胎进行了冷冻[10]。此后，其越来越广泛应用于其他哺乳动物如马、山羊、绵羊等。玻璃化冷冻法操作简单、方便省时，但是高浓度的冷冻保护剂无疑对细胞产生更大的毒性危害。

1.3.3 干燥冷冻法

干燥冷冻法利用冰升华的方式使细胞内的水分快速移除，从而抑制胞内生化反应。此方法能在4 ℃乃至常温下长期储存精子，极大缩减保存成本。冷冻后的精子会丧失活力，但保留受精能力和自身DNA完整性。卵胞浆内单精子注射技术的发展使得精卵结合不再受精子活力的影响，无疑推进了干燥冷冻法的发展。Olaciregui等已将其成功运用于动物精子的冷冻[11]，但干燥冷冻法对精子超微结构的影响还有待研究。

有研究[12-13]认为，慢速程序化冷冻法采用的CPA浓度较低、毒性较小，利于保存细胞活性；也有研究表明，玻璃化冷冻法使细胞内外的水直接转化为“玻璃化”状态，减少冰晶，更有利于保存细胞形态[14]。综上，究竟哪种方法更有利于保存细胞还存在争议。不同比较角度可能导致得出的结论大相径庭[15]。

2 冷冻保存对细胞的影响

2.1 低温保护剂类型影响

生物组织中包含很多以电解质水溶液形式存在的水。水溶液的冻结对生物体是致命的，所以要事先加入冷冻保护剂（cryoprotective agent,CPA）。常用的CPA分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。CPA可以通过降低细胞渗透性脱水、阻止冰晶形成、延缓冻结过程、增强样品低温耐受性等来减少低温保存过程中冷冻对生物样品的损伤[16]。虽然CPA在一定程度上能减少生物样品在低温保存中的损伤，但其本身也具有生物毒性，浓度过高的CPA自然而然会对细胞造成毒性损伤[17-18]。因此，开发高效无毒的低温冷冻保护剂意义重大。

2.1.1 渗透性低温保护剂

渗透性低温冷冻保护剂分子量较小，可以通过渗透扩散的方式进出细胞，起到调节渗透压并减轻胞内冰晶损伤的作用。但此类保护剂一般都具有毒性，常用的主要有乙二醇、二甲基亚砜、甘油等，其中甘油对于大多数细胞渗透性都很低，应用较为有限。乙二醇具有较强渗透性且兼具低毒性[19]，而二甲基亚砜玻璃化能力较强但细胞复苏时难以彻底清除。因此，目前的冷冻保护剂多选用乙二醇和二甲基亚砜的混合液，以获得作用效果最好、毒性最低的冷冻保护液，使效果增强且毒性降低[20]。

2.1.2 非渗透性低温保护剂

非渗透性保护剂分子量较大，必须采用辅助手段才能进出细胞，具有低毒性，能促进细胞外液形成玻璃化。主要包括蔗糖、海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等，主要与渗透性低温保护剂协同使用。此外，通过添加牛血清白蛋白等一些生物活性物质，能够起到稳定细胞膜、阻止卵母细胞在冷冻过程中透明带硬化的作用[21]。

2.1.3 抗冻蛋白低温保护剂

鉴于传统冷冻保护剂存在明显的毒性问题，人们尝试寻找天然物质来代替有机溶剂充当保护剂的角色，抗冻蛋白就是其中的代表。抗冻蛋白发现于南极的鱼类中，这类鱼生活在零下温度的极地海洋。但是抗冻蛋白作为一种生物来源的外源物，用于人体时易引起免疫排斥反应。加之其分离较难，目前难以广泛应用[22]。

2.2 冷冻解冻速率影响

2.2.1 冷却速率

冷冻过程中，细胞受到损伤的主要温度为0 ℃和-60 ℃[23]。细胞外液在-5 ℃到-10 ℃之间时形成冰晶，但细胞内的水还未达到结晶程度。这时如果冷冻速率很高，细胞内的水不能完全渗出，形成冰晶，会导致细胞受到机械损伤；如果冷冻速率很低，细胞中大部分水分渗出，细胞内溶质浓缩，细胞持续处于高渗状态，持续收缩，使细胞器和细胞膜受损。此外，离子平衡在高渗环境下会被打破，从而使细胞在解冻过程中极易超过等渗体积形成肿胀[24]。因此，过高或过低的冷冻速率都可能导致细胞受到冷冻损伤，只有寻找到合适的冷却速率才能达到相对平衡点，从而减轻胞内冰晶对细胞的损伤。

2.2.2 解冻速率

冻存过程会对细胞造成机械损伤，解冻过程依然避免不了冰晶的形成，造成细胞损伤。解冻速率的快慢主要通过水浴温度来调节。在解冻细胞的早期研究中，科学家采用在37 ℃的水浴中解冻12 s～30 s，或置于5 ℃的水浴中解冻2 min，比较发现快速解冻优于慢速解冻[25]。研究表明低解冻速率会导致胞内再结晶，且由于进入胞内的渗透保护剂移除速率较慢，加剧胞内外渗透压的形成，使水分快速渗入细胞，最终破坏其质膜结构。因此，解冻过程中细胞内外渗透压的平衡点，对找到最佳的解冻速率至关重要。

3 细胞冷冻保存的应用与存在问题

3.1 卵母细胞

低温保存卵母细胞会对其造成冰晶损伤、毒性损伤及渗透损伤，这将阻止细胞解冻后的质量提升。冻存成熟卵母细胞的主要问题是纺锤体对低温及冷冻保护剂有很强的敏感性，极易在冻融过程中受到损伤。未成熟卵母细胞却能较好地规避这一问题，其不具备纺锤体结构，避免了因纺锤体结构受到影响而导致的遗传物质受损等问题的产生。但未成熟卵母细胞冻融后的体外培养技术并不成熟，解冻后在体外难发育为优质成熟卵母细胞，面临的受精差等问题还亟待解决[26]。

目前有学者提出将微流控法添加-去除保护剂分别与冷冻载体配合使用，选用透明陶瓷和玻璃制作集成一体化芯片冷冻保存猪卵母细胞，发现冻后质量得到提高。这或许能为卵母细胞的低温保存提供一个新的思路[27]。

卵母细胞冷冻保存技术避免了与未来使用相关的潜在问题，储存女性生殖潜能可为那些生育能力受到细胞毒性治疗威胁的妇女提供未来受孕的机会，因此更普遍地被接受。该技术的进步，特别是玻璃化的临床应用，已经显著地改善了成熟卵母细胞冷冻保存的效果，这与胚胎冷冻保存的结果相当[28]。当玻璃化人卵母细胞产生有活力的囊胚时，活产成功与新鲜卵母细胞相当[29]。卵母细胞质主要通过缝隙连接和颗粒细胞进行胞间交流从而加速胞质成熟[30]，这一渠道极其脆弱，在冻融过程中很容易遭到破坏。所以在冻存以前，应当先采用IVM技术对未成熟卵母细胞进行培养，直至其成熟。虽然此种冻存方法已有多篇报道，但成功案例较少[31]，亟待进一步优化。

宿主的客观因素(年龄、供卵者和非供卵者卵母细胞质量等)、冷冻方法的选择、冷冻设备的质量等都可以影响卵母细胞冷冻保存成功率[32]。加强对卵母细胞的冻存技术研究，有助于帮助因患卵巢早衰等生育疾病的妇女解决生育问题，对家庭及社会具有重要的研究意义。

3.2 精子细胞

精子目前为止是最常见的干燥细胞类型，主要来自小鼠和公牛。已经应用了多种干燥方法，其中冷冻干燥占主导地位。迄今为止，小鼠精子、大鼠精子、仓鼠精子、兔精子及马精子均已产生后代。超低温保存的发展没有超出大多数水生物种的探索性研究的地位，缺乏广泛的应用。对于大多数水生物种来说，除了精子或体细胞之外，生物材料并没有被全面地储存起来，以代表和保存每个物种的广泛的遗传多样性[33]。干燥的细胞在复水后大多不能恢复生物活性[34]。冻存人类精子的方法比较多，但常规方法均不利于精子量较少的样本保存，精液标本在冷冻之前需加入冷冻保护剂，稀释后精子密度急剧下降，加大冻融后寻找到合适的精子难度[35]。解冻后，精子标本需要经过洗涤处理去除冷冻保护剂，这将进一步丢失更多的精子。但当以空卵透明带为精子冻贮载体，再把精子显微注射入其内能较好冻存较少数量的精子[36]。另外，有研究表明，MQ秸秆与GEYC联合作为低温保护剂有利于低计数精液的低温保存[37]。也有相关实验证明冷冻前的梯度准备在冷冻前和融化后均能产生具有更好的活力的冷冻活体，更有利于精子的冷冻保存[38]。此外，未成熟精子体外培养技术及精原干细胞移植技术尚未成熟，因此临床实践中未广泛开展。

3.3 组织、胚胎和幼虫

胚胎冷冻保存有可能成为保护濒危动物品种的有价值的工具[39]。由于过度捕捞，可食用的红海胆、白鳍豚的自然种群正在减少。该物种的胚胎和幼虫对于监测海洋污染非常有用，因此有必要保护胚胎和幼虫，以促进其在水产养殖和环境质量监测的不同领域的使用[40]。癌症或其他疾病的化疗和放射治疗可导致永久性不孕。虽然青春期和成年男性在治疗之前可以选择冷冻保存精子，但对于尚未产生精子的青春期前男孩来说，这并不是一个可以实施的选择，人睾丸组织低温保存技术的研究就很有必要[41]。目前有关研究都已经取得一定进展，但冻后存活率和解冻后活性依然不尽如人意，有待进一步研究。

4 结论

低温保存虽已取得了明显的效益，但仍是远未了结的课题。近年来，人们对低温保存的兴趣和研究成果急剧增加。目前能实现低温保存的生物体，大多数是简单的细胞，所谓组织保存，也是保存其中最主要的细胞。对干细胞的低温保存也并非轻而易举。总之还需更进一步地研究低温损伤机理，研发新的技术，探索新的保存程序，从而实现对更复杂的细胞、组织和器官实现低温保存。