嘉氏羊蹄甲组织培养体系的建立*

何超银 魏 丹 唐洪辉 许冲勇蓝燕群 冯志坚 陈友光 张 耕

（1.广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520；2.华南农业大学,广东 广州510642；3.广东如春生态集团有限公司，广东 广州 510530）

嘉氏羊蹄甲Bauhinia galpinii 又名橙花羊蹄甲，为苏木亚科Leguminosae 羊蹄甲属Bauhinia常绿攀援状灌木。嘉氏羊蹄甲原产南非地区，我国广东省、香港特别行政区均有分布。因其枝条细软平展，花量大，花期长，花大而橙红似火，花序簇生枝头如火凤凰一般，热烈奔放，花姿花色美妍悦目，是一种观赏性较高的园林植物[1-4]。此外，嘉氏羊蹄甲具有重要的药用价值，在胃肠道疾病、癫痫、抽搐等疾病治疗中均有应用。同时，嘉氏羊蹄甲还具有重要的生态价值[5]。

组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。目前，关于羊蹄甲属植物的组织培养与快速繁殖主要集中于红花羊蹄甲Bauhinia blakeana 等[6]。而目前嘉氏羊蹄甲的栽培方式主要采用播种繁殖，但因受自然气候条件和授粉因子的影响，其果实结实率低，种子收集困难。播种繁殖后代存在开花结果迟，且有较大的遗传变异性，繁殖速度慢的缺点。近年来，嘉氏羊蹄甲逐渐广泛应用于园林，因此快速提供大量优质苗木具有重要意义。本研究取嘉氏羊蹄甲带腋芽茎段为外植体，采用正交试验方法，建立了嘉氏羊蹄甲的快繁体系，为嘉氏羊蹄甲工厂化育苗和产业化生产提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料嘉氏羊蹄甲于2019 年春季采自广东省林业科学研究院，采其当年生生长健壮、腋芽饱满、无病虫害的嫩枝，喷水后带回实验室备用。

1.2 方法

1.2.1 无菌外植体的获得 试验当日上午采外植体后将采集的嫩枝去掉叶片，剪成约5 cm 的带芽茎段，用小牙刷轻轻清洗干净后，放入广口瓶，广口瓶上盖上纱布，用自来水冲洗约2 h。在超净工作台上，用加入2 滴吐温80 的0.1%升汞，消毒处理5 min，消毒过程中轻微晃动瓶子，无菌水冲洗6 次后，用无菌滤纸吸干茎段表面的水分后，用无菌刀片将经消毒的枝条切成长1～2 cm 的茎段，每个茎段带1 个腋芽。

1.2.2 初代培养 将经消毒的带芽茎段接种在附加6-BA（0.1,0.5,1.0 mg·L-1)和NAA(0.05 mg·L-1)的MS 培养基中，经过15 d 的培养后统计腋芽诱导率并观察生长状况，每个处理接种30 瓶，每瓶1 个外植体，重复3 次。腋芽诱导率=（萌发的腋芽总数/接种外植体腋芽总数）×100。

1.2.3 增殖培养 初代培养30 d 后，选取健壮的试管苗，将其从初代培养基中切下取出，接种在增殖培养基上培养，以3 种基本培养基附加不同浓度的6-BA、IAA 和NAA，采用4因素3水平正交试验L9（34）设计（表1），共9 个处理。每个处理接种30 瓶，每瓶接2 个外植体，重复3 次。30 d 后统计芽苗的增殖率苗和观察芽苗的生长状况。增殖率=（增殖芽总数/接种芽数）×100。

表1 嘉氏羊蹄甲芽增殖试验因素及水平 mg·L-1Table 1 Factors and levels of bud proliferation test of Bauhinia galpinii

1.2.4 无菌苗生根培养 选取增殖培养所得的生长健壮、叶片展开的高度约2 cm 的无菌苗为材料进行生根培养试验，以1/2MS 为基本培养基附加不同浓度的IBA、IAA 和NAA，按L9（33）正交试验设计试验（表2），每个处理10 瓶，每瓶接种5 个芽，重复3 次。培养15 d 后统计生根率及观察生长状况。生根率=（生根芽数/接种芽数）×100%

表2 嘉氏羊蹄甲组培苗生根试验因素及水平 mg·L-1Table 2 Rooting test factors and levels of tissue culture seedlings of Bauhinia galpinii

1.2.5 移栽培养 将生根15 d 后的试管苗打开瓶盖，放在大棚中炼苗2～3 d,用镊子轻轻取出培养瓶中的试管苗，用自来水轻轻将卡拉胶清洗干净后移栽到混合基质（泥炭、黄心土、珍珠岩体积比分别为：1:1:1）中，用塑料膜盖盆口，保持湿润，30 d 后统计移栽成活率。移栽成活率=（移栽成活株数/移栽总株数）×100。

1.2.6 培养条件 以上初代培养及增殖培养的培养基中均添加3.0%蔗糖和0.7 的卡拉胶，生根培养基中添加1.5%蔗糖和0.7 的卡拉胶，pH为5.4～5.6，121℃高温灭菌20 min。培养温度为（27±1）℃，光照强度为50 μmol·m-2·s-1,光照时长为14 h·d-1。

1.3 数据分析

数据采用SPSS19.0 软件进行方差分析和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的6-BA 对嘉氏羊蹄甲腋芽诱导的影响

将嘉氏羊蹄甲无菌带腋芽茎段接种到以MS 为基本培养基，并含有不同浓度6-BA 和0.05 mg·L-1NAA 中，产生不同的培养效果（表3）。嘉氏羊蹄甲在低浓度6-BA 的诱导中，诱导效果最差，为53.33%，在6-BA 为0.5 mg·L-1的培养基中，其诱导率为80.00%，但6-BA 为1.0 mg·L-1时，其诱导率为58.82%。综合其诱导率和生长情况，最佳的诱导培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA。

2.2 培养基对嘉氏羊蹄甲增殖培养的影响

将嘉氏羊蹄甲试管苗接种到含有不同基本培养基和不同浓度的6-BA、IAA、NAA 组合的培养基中，15 d 后开使萌发增殖芽。对不同处理下嘉氏羊蹄甲试管苗增殖状况的统计结果见表4。由表4 可知，9 个处理中，增殖系数最高的处理为WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1IAA，其增殖系数为4.62，极显著高于其他处理（P<0.01）。增殖系数最低为处理N6+0.10 mg·L-16-BA，极显著低于其他处理。

表3 不同6-BA 浓度下嘉氏羊蹄甲初代诱导的结果Table3 Results of different 6-BA concentrations on the induction of Bauhinia galpinii

表4 不同培养基下嘉氏羊蹄甲试管苗增殖培养的结果 mg·L-1 Table 4 Results of different media on proliferation of tissue culture seedlings of Bauhinia galpinii

极差反映了各因子对嘉氏羊蹄甲试管苗增殖的影响，极差值越大，则影响越大。根据表4 因素的极差值可知，6-BA 最大、IAA 次之、培养基种类再次、NAA 最小，表明在此次正交试验中，影响水平最高的为6-BA、其次IAA、培养基种类、NAA影响最小。通过K 值的计算，基本培养基最佳水平为2，即WPM；6-BA 浓度最佳水平为2，即为0.50 mg·L-1；IAA 最佳水平为3，即0.40 mg·L-1；NAA 最佳水平为1，即0.00 mg·L-1。因此，极差分析表明最佳的增殖培养基为WPM+0.50 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1IAA，这与方差分析结果一致。

图1、2 显示，在上述最佳培养基培养下，通过增殖培养获得的组培苗数量多，生长健壮，叶片嫩绿且无玻璃化现象。

图1 嘉氏羊蹄甲增殖培养Fig. 1 Multiplication culture of Bauhinia galpinii

表5 不同激素配比下嘉氏羊蹄甲组培苗的生根结果 Table 5 Results of different phytohormones on rooting of tissue culture plantlets of Bauhinia galpinii

图2 嘉氏羊蹄甲生根培养Fig. 2 Rooting culture of Bauhinia galpinii

2.3 不同质量浓度激素组合对嘉氏羊蹄甲生根的影响

将嘉氏羊蹄甲组培苗接种到含有不同激素及其质量浓度组合的培养基中，培养15 d 后，组培苗基部生根（图2）。由表5 可知，3 种激素中6-BA 的极值最大，IAA 次之、NAA 最小，说明此次试验的3 种激素中，对嘉氏羊蹄甲的生根培养影响因素最大的是6-BA、其次是IAA，最后是NAA。由表可以看出，6-BA 浓度对嘉氏羊蹄甲生根培养的影响尤为显著。其中，6-BA 浓度为1.00 mg·L-1时生根率最高，生长效果最好，生根率最高为100%，平均生根率为80%；较质量浓度为0.05 mg·L-1的平均生根率高出50%，较质量浓度为1.50 mg·L-1的高出了18.18%。根据3 个因素的极差的大小，可以得出对生根率大小产生效应的主次顺序为6-BA、IAA、NAA。由极差分析可知，生根培养基的最佳组合为1/2MS+1.00 mg·L-16-BA+ 0.50 mg·L-1NAA+0.10 mg·L-1IAA +15 g·L-1蔗糖+ 7 g·L-1卡拉胶。由T 检验也可以得出，此配方生根率极显著高于其他处理。

2.4 不同移栽基质组合对嘉氏试管苗移栽成活率的影响

生根30 d 后，在光照培养室中打开瓶盖约3 d，然后用镊子将组培苗夹出，用清水轻轻清洗基部残留的卡拉胶，然后移栽到装有混合基质的育苗盘中。由表6 可知，在黄心土、泥炭和珍珠岩体积比为1:3:1 时，嘉氏羊蹄甲试管苗的移栽成活率最高，可达86.7%，且生长健壮。因此，最佳的移栽基质为V（黄心土）：V（泥炭）：V（珍珠岩）=1:3:1。

表6 不同移栽基质体积比下嘉氏羊蹄甲试管苗移栽成活率Table 6 Comparison of transplanting survival rate of Bauhinia galpinii test-tube seedlings with different transplanting substrate volume ratios

3 讨论与结论

外植体消毒是组织培养体系建立中重要的一步。在本试验中，采用了在升汞中滴加吐温80 的方法进行外植体消毒，以获得无菌嘉氏羊蹄甲带腋芽的茎段。吐温80 是一种非离子型表面活性剂，能增加灭菌剂在外植体表面的附着性和沉积量，提高有效成分在水分调价的释放速度和扩展面积，从而达到增加灭菌效果的作用[7]。因此，在升汞中滴加吐温80，能进一步提高灭菌效果。

在植物腋芽萌动过程中，不同种类不同浓度的植物生长调节物质的配比对腋芽萌发起着重要作用[8]。在本研究中发现，以嘉氏羊蹄甲带腋芽茎段为外植体，腋芽萌动时间和生长状况在含有不同浓度的6-BA 诱导培养基上有较大的差异性。最佳诱导培养基MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，其诱导率高达80.00%，且诱导芽芽萌动时间短，生长健壮，长势较好。这与袁云香等[9]的研究结果相似。

在组织培养中，继代增殖培养是组织培养的关键。不同的基本培养基与不同的激素及其质量浓度的搭配会对试验的结果造成很大的影响[8]。本试验在研究过程中发现，在增殖阶段嘉氏羊蹄甲试管苗在含有WPM 的培养基中生长得较好，这可能是因为低浓度无机盐的培养基更有利于嘉氏羊蹄甲生长，这与青钱柳Cyclocarya paliurus 的研究结果相似[10]。而6-BA 和IAA、NAA 的组合为增殖培养中较为常见的搭配，因此，本试验采用这3个植物生长调节剂进行试验，研究表明最适合嘉氏羊蹄甲的增殖培养基是WPM+0.50 mg·L-16BA+0.40 mg·L-1IAA，增殖系数最高，组培苗生长快且健壮，无玻璃化现象。

在组织培养中，降低无机盐的用量有利于无菌苗生根，因此，本试验选择1/2MS 基本培养基作为基本培养基。而组培苗生根过程中加入NAA能使试管苗的根系粗壮，但在移栽过程中根系易断裂，而加入IBA 能使根系粗细适中，且移栽成活率高。因此在生根过程中，选择NAA 和IBA。生根培养对于试管苗移栽成活有非常大的影响，本试验通过优化生根培养的培养基，最终能使嘉氏羊蹄甲在30 d 的平均生根率达到80.00%，并且根系长度粗细适中，植株嫩绿。

移栽成活率是组织培养技术能否应用于大量生产的关键。试管苗移栽初期必需保持高湿、弱光和适宜的温度。本研究通过研究表明，嘉氏羊蹄甲在V（黄心土）: V（泥炭）: V（珍珠岩）＝1:3:1 中，其移栽成活率最高，为86.7%，且移栽后生长较好。

通过试验，本研究最终建立了嘉氏羊蹄甲的组织培养体系。结果表明，最适合的初代培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA，最适合的增殖培养基为WPM+0.50 mg·L-16BA+0.40 mg·L-1IAA， 最 适 合 的 生 根 培 养 基 为1/2MS+1.00 mg·L-1IBA +0.50 mg·L-1NAA+0.10 mg·L-1IAA，而最佳移栽基质为V（黄心土）: V（泥炭）: V（珍珠岩）＝1:3:1。