油茶根际土壤解钾菌的发酵培养

吴 松，王美鑫，张晓阳，张媛媛，韩森汇，宋 漳

(福建农林大学林学院，福建 福州 350002)

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)为山茶科山茶属植物，是我国重要的经济林树种[1]，与油橄榄、油棕、椰子并称世界“四大木本油料植物”[2-3]。由油茶籽加工的茶油富含不饱和脂肪酸，其营养价值可与橄榄油相媲美，是优质健康的植物食用油，被誉为“东方橄榄油”，长期食用可增强人体免疫力、降低胆固醇、预防肥胖和心血管等疾病[4]。

钾作为植物生长发育所必需的营养元素[5]，参与多种酶的活化，促进植物生长发育，参与细胞渗透作用和物质运输，增强植物抗病等抗逆性[6-7]。然而，土壤中95%的钾元素都以矿物质的形式存在于钾长石和云母中，不能被植物直接吸收利用[8]。解钾菌(Potassiumbacteria)又称硅酸盐细菌，是从土壤中分离出来的，能将难溶性钾等矿物质元素转变为可溶性物质供植物吸收利用的微生物[9]。除了能溶解矿质元素外，解钾菌还能产生促进植物生长的激素，有利于植物生长和提高品质[10]。韩晓阳等[11]从茶园土壤中分离、筛选出最强菌株K2，进行条件优化施用后发现茶叶各项指标都有提升；伍善东等[12]从油菜田土壤中分离解钾能力最强的菌株JK-3发酵培养优化，发现该菌株的发酵液的浓度有明显提高。本试验以从油茶根际土壤采集分离的解钾优良活性菌株为对象，筛选优化培养条件，以期为高效微生物肥料研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

解钾细菌为已分离的15株油茶根际解钾菌，菌株编号为CoPDB 1—CoPDB 15，保存在福建农林大学森林保护研究所。

1.2 供试培养基

种子培养基：蔗糖5.0 g，磷酸氢二钾0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，淀粉5 g，硫酸钙0.1 g，硫酸铵1.0 g，氯化钠0.2 g，碳酸钙0.5 g，水1000 mL；培养基A：蔗糖5.0 g，磷酸氢二钠0.5 g，云母粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化铁0.005 g，水1000 mL；培养基B：蔗糖5.0 g，磷酸氢二钠0.2 g，云母粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化铁0.005 g，硫酸铵1.0 g，碳酸钙0.1 g，水1000 mL；培养基C：蔗糖1.0 g，磷酸氢二钠2.0 g，云母粉1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，氯化铁0.005 g，硫酸铵1.0 g，碳酸钙0.1 g，淀粉5.0 g，水1000 mL。

1.3 解钾细菌筛选

用双层平板法[13]筛选解钾细菌，下层倒云母琼脂培养基，上层倒硅酸盐培养基，将15株菌株接种在双层平板上。30 ℃培养4 d，选取菌落直径大、表面粘稠性好、解钾圈大的菌株进行发酵优化。

1.4 筛选菌株的活化

将CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液接种于种子液体培养基，30 ℃、200 r·min-1条件摇培3 d，获得一级种子菌液。取一级种子菌液5 mL分别接种于种子液体培养基，同等条件继续摇培3 d，获得二级种子菌液，同样操作获得三级种子菌液，活化供试菌株。

1.5 筛选菌株的生物量及钾含量测定

用紫外分光光度法测定生物量[14]。将菌株种子液置于30 ℃、200 r·min-1摇床培养10 d，每天定量吸取种子液3 mL于比色皿中，以纯净的培养基为对照，每个样品重复3次；对照比色皿放在第一个，其余样品依次排列，采用分光光度计波长600 nm检测，对照组进行校对，其余样品依次检测，记录每天样品测定值。钾含量测定采用火焰光度计法[15]：吸取发酵液10 mL，4000 r·min-1离心后吸取少许上清液，用火焰光度计测定其钾的含量。

1.6 发酵条件优化方法

1.6.1 培养基筛选 吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液各5 mL分别接种于培养基A、培养基B、培养基C，在30 ℃、200 r·min-1条件下摇培7 d，以不接种液体培养基为对照，各3次重复。取少量菌液用比浊法测定OD值，火焰光度计测定钾含量，选出最优培养基。

1.6.2 pH 分别在250 mL的锥形瓶中装入最优液体培养基50 mL，调节pH值为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2，高压灭菌；分别吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液各5 mL接种至不同pH的液体培养基中，于30 ℃、200 r·min-1条件下摇培7 d，以pH 7.0不接种培养基为对照，每处理3次重复。取少量菌液用比浊法测定OD值，火焰光度计测定钾含量，筛选最佳pH值。

1.6.3 装液量 在250 mL的锥形瓶中分别装入50、75、100、125、150、175 mL的液体培养基，经灭菌消毒后，分别吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的菌液各5 mL接入含有不同量液体培养基的锥形瓶中，在30 ℃、200 r·min-1条件下摇培7 d，以不接种的液体培养基为对照，各3次重复。取少量菌液用比浊法测定OD值，火焰光度计测定钾含量，筛选最佳装液量。

1.6.4 接种量 分别吸取CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的种子液各1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL接入液体培养基，于30 ℃、200 r·min-1条件下摇培7 d，以不接种的液体培养基为对照，各3次重复。取少量菌液用比浊法测定OD值，火焰光度计测定钾含量，筛选最佳接种量。

1.6.5 温度 分别吸取最适接种量的CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的种子液接入液体培养基，分别在24、26、28、30、32、34 ℃等不同温度，200 r·min-1条件下摇培7 d，以不接种的液体培养基为对照，每处理3次重复。取少量菌液用比浊法测定OD值，火焰光度计测定钾含量，筛选最佳温度。

1.6.6 摇床转速 分别吸取最适接种量的CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15的种子液接入液体培养基，分别在30℃，120、140、160、180、200、220 r·min-1转速条件下摇培7 d，以不接种的液体培养基为对照，每处理3次重复。取少量菌液用比浊法测定OD值，火焰光度计测定钾含量，筛选最佳摇床转速。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

双层培养法观测结果(图1)表明，各供试解钾细菌菌株的解钾能力各异，其中CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15解钾细菌的R/r值>1(R为透明圈直径，r为菌落半径)，解钾能力较强，故选取这3株效果较好的解钾细菌菌株进行发酵条件优化试验。

图1 解钾细菌的筛选

2.2 生长曲线

从图2、图3可看出，3种解钾菌的生物量和解钾能力均随时间的增加先缓慢增长、再急剧增长、最后下降，解钾细菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15均在7 d时解钾能力和生物量达到最高值。可见，摇培7 d为解钾菌株最适培养时间。

2.3 发酵条件优化结果

2.3.1 培养基 在供试的3种培养基中，解钾细菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15都可正常生长，其中在培养基A中的生物量最佳。3种解钾菌在培养基A中的生长与培养基B、C差异显著(图4)。解钾细菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在培养基A中的解钾能力最强。其中，解钾菌CoPDB 6、CoPDB 13的解钾能力在培养基A中显著高于培养基B和培养基C，而解钾菌CoPDB 15在3种培养基中不存在显著差异(图5)。

2.3.2 不同pH对解钾细菌的影响 从图6可以看出，解钾菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在不同pH下都能生长，pH为7.4时生长最好，生物量达到最大值。图7表明，随着pH值升高供试菌株解钾能力随之增强，达到最大值后下降明显，最后趋于平稳，CoPDB 6菌在pH为7.4时解钾能力最好，CoPDB 13菌和CoPDB 15菌在pH为7.2时解钾能力最强。

2.3.3 不同装液量对解钾细菌的影响 从图8可以看出，在接种量固定的情况下，供试菌株生长量总体上随着装液量的增加而减少，呈递减趋势，以20%(即50 mL/250mL钾细菌生物量)装液量发酵培养菌株产量最高，为最适装液量。数据分析结果可得出，3株解钾菌在装液量为20%时解钾细菌生物量显著高于其它装液量。解钾能力测定结果(图9)表明，3株解钾菌株随着装液量的增加解钾能力呈下降趋势，CoPDB 6、CoPDB 13菌株在装液量20%(即50 mL/250 mL)时解钾能力最好，CoPDB 15菌在装液量30%(即75 mL/250 mL)时解钾能力最好。总体来说，装液量在20%～30%时，解钾细菌的生长和解钾能力最优。

2.3.4 不同接种量对解钾细菌的影响 从图10、图11可以看出，解钾菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在接种量增加的情况下，生物量和解钾能力总体呈现先增长趋势，在达到最大值后开始下降，以接种量为9%(即4.5 mL/50 mL)的情况下生长量和解钾能力最佳。在接种量为9%(即4.5 mL/50 mL)时，3株菌株的生长量和解钾能力显著高于其它接种量。

2.3.5 不同温度对解钾细菌的影响 由图12、图13可知，解钾菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15在30 ℃时生长最优并且解钾能力也最好。3株解钾菌均在30 ℃时，菌株的生长和解钾能力与其它温度间存在显著性差异；在解钾能力方面，3株菌株除30 ℃外，其它温度间差异不显著。因此，解钾菌的最适生长发酵温度为30 ℃。

2.3.6 不同摇床转速对解钾细菌的影响 由图14、图15可知，解钾菌CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15菌株在不同转速下均能生长，菌株OD值最高和钾含量最高时的转速为200 r·min-1。即摇床转速200 r·min-1是解钾菌生长发酵最适条件。

3 小结与讨论

油茶作为经济树种具有很高的经济、健康、营养价值[16]。钾素是植物生长的必要元素，能促进植物的生长代谢。土壤中虽含有大量的钾元素，但大多数都是以硅酸盐矿物的形式存在，不能被植物吸收[17]。解钾菌具有高效的解钾能力，苟志辉[18]从油茶根际中分离出73株解钾菌，经筛选K50菌株的解钾最强，解钾率达121.71 mg·kg-1；姜霁航等[19]从苹果根际分离118株具有解钾活性的菌株，菌株K105的解钾最高有效态钾增长23.09%。盛下放等[20]分离筛选的解钾硅酸盐细菌NBT菌株，其释钾量较对照增加226.0%。此外，解钾菌还具有促进生长的功效，曹媛媛等[21]从烟草根际筛选获得4株能促进烟草生长的解钾菌，其中TK89促进效果最佳，不论在烟草哪个部位接种都能起到促进生长的效果；崔松松等[22]对油菜根际解钾菌的研究中发现，解钾菌能促进油菜生长，增加产量。解钾菌对植物的生长发育有着重要的作用，本研究采用双层平板法对保存于实验室的15株解钾菌的解钾能力进行测定，筛选出3株解钾能力较强的菌株，即CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15。

解钾菌的培养条件对解钾能力有较大影响，通过影响其生长和代谢使解钾能力产生差异。本研究中，3株(CoPDB 6、CoPDB 13、CoPDB 15)解钾菌的培养时间均在7 d时解钾能力最佳，此后培养时间越长解钾能力下降较快；在培养基A中，pH为7.2～7.4，温度为30℃、摇床转速为200 r·min-1时解钾菌的解钾能力最强，说明解钾菌的适生环境为偏碱性，该结果与吕睿等[23]从猕猴桃土壤中分离出的解钾菌的生存环境一致；3株解钾菌在装液量为20%～30%(50～75 mL/250 mL)时解钾能力最好，当装液量逐渐增加时解钾力下降，由此可见解钾菌是属于好氧型生物，在氧气充足的条件下自身的代谢能力更好；接种量的选择不仅要考虑解钾能力的强弱，还需考虑生产实践中的经济效益，3株解钾菌在接种量为9%时解钾效果最好。本研究对油茶根际解钾菌的发酵研究结果表明，解钾菌的接种量为9%、温度30 ℃、转速200 r·min-1时解钾效果最佳。与苟志辉[18]对油茶解钾菌条件优化的结果稍微有点差异，苟志辉的研究结果是最佳发酵接种量4%、温度35 ℃、装液量50 mL、转速160 r·min-1。可能由于所采样的地域不同，地域环境条件对解钾菌的生存产生影响。