红花黄色素超声辅助提取工艺优化及其稳定性

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（中南林业科技大学 材料科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

红花Carthamus tinctorius为桔梗目菊科植物，别名红蓝花，主要产于河南、四川、新疆等地。红花与鸢尾科多年生草本植物藏红花非同一物种，但同样具有活血化瘀，散湿祛肿的医用功效[1-2]。在同等剂量条件下红花的效力远不及藏红花，且其种植面积广、产量高，因此红花的价格较藏红花要低得多。此外，红花具有良好的染色性能，可直接用其对纤维染色[3]。近几年，随着环保意识的加强，人们对产品的生态性、安全性要求越来越高。绿色环保的植物染料因具有对环境污染小、对人体健康有益等特点而重回大众的视野。红花黄色素的提取工艺也越来越被人们关注[4]。目前，天然色素的提取方法主要分为3 种：有机溶剂提取法、酶提取法和物理辅助提取法[5]。有机溶剂提取法具有提取效果好、操作简单、成本低等优点。Kumar 等[6]使用甲醇、乙醇进行色素提取，获得了较高的提取率。虽然提取过程高效快捷，但是废渣和废液中非环境友好的有机试剂会对环境造成影响。酶提法常被用于具有生物活性物质的提取。Swer 等[7]探究了使用纤维素酶从李子中提取花青素的最优工艺。但酶的培养操作复杂且成本一般较高，故在一般色素的提取过程中应用较少。物理辅助提取法主要包括超声辅助提取法、微波辅助提取法、超临界辅助提取法[8]等。采用物理辅助提取法可明显缩短提取时间，改善提取效果。Martínez 等[9]采用超声加压的方法以水为介质对酵母中的类胡萝卜素进行了提取，结果表明该方法对类胡萝卜素的提取率达82%。超声波因其特有的空化作用和机械作用，可促进溶剂的渗透和细胞内化合物的释放[9]，被广泛用于色素的提取。

红花黄色素中存在大量的酚羟基和醇羟基等活性基团，因此其在水中的溶解性能良好。本试验中以红花干燥花为材料，采用超声辅助热水提取法提取红花中的黄色素，通过单因素分析，研究提取液pH、超声功率、超声时间、水浴温度和水浴时间等因素对红花黄色素提取率的影响，应用响应面法优化提取工艺参数，并对红花黄色素的储存稳定性进行了初步探究。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

试验材料：试验用红花购于南通水色商贸有限公司，原产地为河南；NaOH、HCl、Na2SO3、H2O2等化学试剂购买于国药集团，且在使用前均未经任何处理；试验用水是使用超纯水系统过滤的超纯水，电阻率不小于18.25 MΩ·cm。

试验设备：101-2A 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（上海央申科技仪器有限公司）、KM-700VDV-3 超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）、UV2310 Ⅱ紫外-分光光度计（上海元析仪器有限公司）、Vector33 傅里叶红外光谱仪（Bruker 公司）、凝胶渗透色谱仪（Waters 公司）。

1.2 方 法

1.2.1 红花黄色素的提取

1）单因素试验。称取经40 目标准筛网筛选的红花粉末5 g 置于锥形瓶中，加入100 mL 超纯水浸泡12 h。分别在不同提取液pH（3、5、7、9、11、13）、不同超声功率（140、210、280、350、420、490 W）、不同超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、不同水浴温度（40、50、60、70、80、90 ℃）、不同水浴时间（30、60、90、120、150、180 min）条件下进行浸提，然后用400目标准滤布过滤提取液，将滤液在12 000 r/min条件下离心5 min。取上清液，稀释20 倍，测定吸光度。

2）响应面试验。在单因素试验的基础上，使用Box-Behnken 试验设计对提取工艺进行优化。以水浴时间、水浴温度、超声功率为自变量，取每种因素的最优水平为0，在最优水平两侧各取1 个水平，以提取率为响应值，设计3 因素3 水平的试验，每组试验重复3 次，取平均值。

1.2.2 红花黄色素得率的测定

精准称量8 mg 红花黄色素标准样，将其在200 mL 去离子水中充分溶解，得到质量浓度为0.04 g/L 的母液。使用紫外分光光度计在波长300 ～600 nm 条件下以800 nm/min 的速率进行扫描，得到红花黄色素母液全波段扫描图谱。红花黄色素母液在不同波长下的吸光度值如图1A 所示。由图1A 可以看出，红花黄色素母液在波长327、400 nm 处分别有1 个明显的吸收峰，选择波长400 nm 处的吸收峰作为后续检测中使用的最大吸收峰。

图1 红花黄色素母液在不同波长下的吸光度值及其标准曲线Fig.1 Absorbance values and standard curves of safflower yellow pigment original solution at different wavelengths

分别取2、4、6、8 mL 红花黄色素母液定容于10 mL 容量瓶中，得到质量浓度分别为0.008、0.016、0.024、0.032 g/L的标准样溶液。在波长400 nm 处分别测定吸光度，将所得数据导入Origin 软件拟合标准曲线，如图1B 所示。得到红花黄色素溶液标准曲线的线性方程：

式中：Y为提取液的吸光度，X为提取液的质量浓度。说明红花黄色素标准液质量浓度在0.008 ～0.040 g/L 范围内线性关系良好。

根据由红花黄色素溶液标准曲线拟合的线性方程和文献[10]中的提取率计算公式，推导可得提取率的计算公式：

式中：R为提取率，Y为提取液的吸光度，n为提取液的稀释倍数，V为提取液的体积，M为红花粉末的质量。

1.2.3 红花黄色素提取液理化性质的检测

使用傅里叶红外光谱仪检测超声处理前后红花黄色素提取液中的官能团[6]，使用凝胶渗透色谱仪测试超声处理前后红花黄色素提取液中物质的相对分子质量[11]。

1.2.4 红花黄色素稳定性的分析

将损失率作为判断红花黄色素稳定性的指标。称取5 g 经标准筛网筛选的红花粉末置于具塞锥形瓶中，加入100 mL 去离子水浸泡12 h，pH 约为7。在80 ℃条件下，水浴加热1 h。滤液经400 目滤布过滤后，在12 000 r/min 条件下离心5 min。取1 mL 上清液定容于25 mL 容量瓶中，混合均匀后过0.45 nm 聚四氟乙烯滤膜备用。按照文献[12]中的方法，在不同的提取液pH、温度、光照时间和氧化还原条件下，进行稳定性试验。在波长400 nm处测定稳定性试验前后溶液的吸光度，分别记为A0、A1。损失率（RL）计算公式[12]为

2 结果与分析

2.1 不同提取工艺参数条件下红花黄色素提取率的比较

提取液pH 对红花黄色素提取率的影响如图2A 所示。由图2A 可见，当浸提液pH 为2 ～11时，红花黄色素的提取率呈先增大、后减小的趋势，当pH 约为7 时存在峰值。这说明红花黄色素在中性条件下可以较好地析出和稳定存在，在酸性和碱性条件下析出速率较慢，且易发生分解，不能稳定存在。当pH 大于11 时，提取率有明显上升，这是因为红花中红色素在碱性溶液中溶解，部分红花红色素析出，使得吸光度增大。因此在红花黄色素的使用过程中应保持中性环境，强酸与强碱环境易造成色素的降解。

超声功率对红花黄色素提取率的影响如图2B所示。由图2B 可见，当超声功率为100 ～500 W时，红花黄色素的提取率呈先增大、后减小的趋势，在超声功率为280 W 处达到最大值。当超声功率低于280 W 时，随着超声功率的增大，产生的空化作用更加明显，色素提取率增大较为明显；当超声功率高于280 W 时，过高的超声功率会使产生空化作用的时间变短，导致溶质来不及析出，提取率反而降低[13]。因此超声功率并不是越大越好，在实际生产应用中应选择合适的超声功率。

超声时间对红花黄色素提取率的影响如图2C所示。由图2C 可见，当超声时间为10 ～60 min时，红花黄色素的提取率呈先增大、后减小的趋势，在超声时间为50 min 时，红花黄色素提取率达到最大值。当超声时间小于50 min 时，红花中的有效成分在超声的空化作用下可以较好地析出，提取率的增长趋势明显；超声时间过长，提取率反而下降，这是由于长时间的空化作用会对红花黄色素结构造成一定的破坏，导致提取率降低[14]。

水浴温度对红花黄色素提取率的影响如图2D所示。由图2D 可见，当水浴温度为10 ～100 ℃时，红花黄色素的提取率呈先增大、后减小的趋势，在水浴温度为80 ℃时达到最大值。这说明适当提高水浴温度可以提高红花黄色素的提取率，加快提取速率，缩短生产周期。但水浴温度过高会对红花黄色素的结构造成破坏[15]，导致提取率下降。

水浴时间对红花黄色素提取率的影响如图2E所示。由图2E 可见，当水浴时间为30 ～180 min时，红花黄色素的提取率呈先增大、后减小的趋势，在水浴时间为60 min 时达到最大值。当水浴时间小于60 min 时，随水浴时间延长，红花黄色素的提取率明显增加，说明红花黄色素在1 h 内即可充分溶解和析出，提取时间过长会使色素成分遭到破坏，导致提取率降低[16]。

图2 各提取工艺参数对红花黄色素提取率的影响Fig.2 Effects of different parameters on the extraction rate of safflower yellow pigments

2.2 红花黄色素提取工艺参数的优化

2.2.1 提取率和各工艺参数回归方程的建立

综合单因素的试验结果，分别选取水浴时间60 min、水浴温度80 ℃、超声功率280 W 作为响应面试验的0 水平，红花黄色素提取试验设计和结果见表1。

表1 红花黄色素提取的Box-Behnken 试验设计和结果Table 1 Box-Behnken design (BBD) experimental design and results of safflower yellow pigment extraction

运用Design-Expert 11 软件对试验数据进行多元回归拟合，得到提取率（R）、水浴时间（A）、水浴温度（B）、超声功率（C）的二元多次回归模型：

R=-5.797 55+0.201 274A+0.085 986B+0.010 768C-0.001 172AB-0.000 164AC-0.000 236BC-0.000 568A2+0.000 414B2+0.000 037C2。

对回归方程进行方差分析，结果见表2。从表2可知，回归方程中的一次项A、C以及二次项AB、AC、A2对提取率的影响显著，二次项BC、B2、C2对提取率的影响不显著。由F值可知，各提取工艺参数对红花黄色素提取率的影响程度由大到小依次为超声功率、水浴时间、水浴温度。同时，模型的F值为6.61，且P值＜0.05，说明使用该模型来模拟各工艺参数对红花黄色素提取率的影响较为可靠且误差小[17]。此外，该回归模型失拟项的F值为0.619 2 ＞0.05，说明失拟项相对于纯误差是不显著的，模型回归方程拟合度良好。

表2 响应面拟合回归方程的方差分析结果†Table 2 Variance analysis results of response surface fitting regression equation

2.2.2 各工艺参数的交互作用对提取率的影响

根据二元多次回归模型，得到各工艺参数间交互作用对红花黄色素提取率的影响。在其中1个因素不变的条件下，另外2 个因素的交互作用对红花黄色素提取率的影响如图3所示。响应面坡度可反映各因素对响应值影响的程度，响应面坡度平缓说明该因素的影响较小，响应面凸起大说明该因素的影响较大[18-19]。从图3可以看出，水浴时间与超声功率之间以及水浴时间与水浴温度之间的交互作用对红花色素提取率的影响均较大，这与方差分析的结果一致。等高线的形状可以反映各因素之间的交互作用对响应值影响的显著性[20]。椭圆形的等高线表示因素间的交互作用对响应值的影响显著，圆形的等高线则表示影响不显著[6]。从图3可以看出，底面等高线较为陡峭，凸起明显，说明水浴时间与超声功率之间以及水浴时间与水浴温度之间的交互作用对红花黄色素的提取率影响显著。

图3 提取工艺参数的交互作用对红花黄色素提取率的影响Fig.3 Effects of the interaction of extraction parameters on the extraction rate of safflower yellow pigment

2.2.3 最佳提取工艺参数的确定及验证

使用Design-Expert 11 软件优化的最佳工艺参数为水浴时间33.756 min、水浴温度90 ℃、超声功率350 W，在此条件下红花黄色素的提取率可达到6.84%。为方便实际操作，将工艺参数调整为水浴时间34 min、水浴温度90 ℃、超声功率350 W。在此条件下进行3 组平行试验，得到红花黄色素提取率平均值为6.33%，与预测值相近，说明该模型模拟结果与试验结果相符，其预测结果准确可靠[21]。

2.3 超声处理前后红花浸提液理化性质的比较

2.3.1 红花黄色素提取液中官能团的变化

红花浸提液的傅里叶红外光谱（FTIR）如图4所示。将3 400 ～3 000 cm-1特征吸收峰指定为羟基（—OH）的振动收缩峰[22]，将1 800 ～1 400 cm-1吸收峰指定为酮（C ＝O）或C ＝C 的振动收缩峰[20]。从图4中可以看出，红花浸提液存在2 个明显的吸收峰，其中波数位于1 640 cm-1的狭窄尖锐峰对应的是酮或者羰基（—COOH）的振动伸缩峰，在2 800 ～3 800 cm-1存在1 个明显的宽峰，可能包括醇羟基（—OH）、酚羟基（Ar—OH）、脂肪链、甲基（—CH3）和亚甲基（—CH2—）的振动伸缩峰[23]。与超声处理前的浸提液相比，超声处理后的红花浸提液在1 643 cm-1处的收缩峰明显增强，表明超声处理会导致一些低键离能（如醚键）的基团发生氧化还原反应生成二苯基丙烯酮[24]，从而使酮含量增加。从图4还可以看出，2 800 ～3 800 cm-1的吸收峰也稍有增强，可能是因为超声处理后浸提液中羟基含量增加。总体来看，超声处理产生的空化作用和机械作用，有利于红花浸提液中有效成分析出。

图4 超声处理前后红花黄色素提取液的傅里叶红外光谱Fig.4 Fourier transform infrared spectra of safflower yellow extract before and after ultrasonic treatment

2.3.2 红花黄色素提取液中物质相对分子质量的变化

为了进一步验证FTIR 的分析结果，对超声处理前后的浸提液进行凝胶渗透色谱（GPC）分析，检测超声前后提取液中物质的相对分子质量，结果如图5所示。从图5中可以看出，超声处理后浸提液的数均相对分子质量和重均相对分子质量均明显减小，说明超声处理可能造成了一些低键离能的化学键发生断裂，从而导致浸提液中大相对分子质量物质减少，小相对分子质量物质增加。由此可见，采用超声波辅助提取有助于红花浸提液中相对分子质量较小的物质析出。

图5 超声处理前后红花黄色素提取液的凝胶渗透色谱Fig.5 Gel permeation chromatography of safflower yellow pigment extract before and after ultrasonic treatment

2.4 红花黄色素的稳定性

提取液pH 对红花黄色素稳定性的影响如图6A所示。由图6A可以看出，提取液pH为1～13时，吸光度整体变化不明显，但在强酸或强碱条件下，损失率上升。这说明红花黄色素具有一定的耐酸碱性，但强酸和强碱会对红花黄色素造成破坏。因此红花黄色素提取液适宜在弱酸性及中性条件下储存。另外，在试验过程中发现，在酸性条件下红花浸提液会有沉淀物析出，碱性条件下溶液无沉淀析出，这是因为红花浸提液中的成分较为复杂，色素部分包含了红花黄色素和红花红色素2种色素，浸提液中部分红花红色素在强酸性环境中沉淀析出。

温度对红花黄色素稳定性的影响如图6B 所示。由图6B 可以看出，随着温度的升高，红花黄色素提取液吸光度的变化不显著。当温度为30 ～45 ℃时，损失率较小；当温度大于45 ℃时，损失率升高。因此红花黄色素提取液的存储环境温度不宜超过45 ℃。

光照时间对红花黄色素稳定性的影响如图6C所示。由图6C 可以看出，随着光照时间的增加，红花黄色素提取液的吸光度呈递减趋势。当光照时间少于2 h 时，红花黄色素提取液的损失率较小；当光照时间超过2 h 后，损失率上升明显且数值较大。说明红花黄色素不可长时间暴露在阳光下，应避光保存。

氧化剂和还原剂对红花黄色素稳定性的影响如图6D—6E 所示。由图6D—6E 可以看出，随着氧化剂和还原剂浓度的增加，红花黄色素提取液的吸光度呈递减趋势，损失率呈递增趋势。当氧化剂H2O2质量分数较低时，红花黄色素提取液的损失率较小；当还原剂Na2SO3质量浓度较低时，红花黄色素提取液的损失率即较高。这说明红花黄色素具有一定的抗氧化性，但是其抗还原性较差。

图6 红花黄色素提取液的稳定性Fig.6 Stability of safflower yellow pigment extract

3 结论与讨论

本试验中以红花为原料，采用超声辅助热水抽提的方法提取红花黄色素，并使用响应面试验设计方法对工艺进行优化。响应面试验结果表明，各因素对红花黄色素提取率的影响程度由大到小依次为超声功率、水浴时间、水浴温度，当水浴时间34 min、水浴温度90 ℃、超声功率350 W 时，红花黄色素提取率达到最大值6.84%。通过平行试验对优化结果进行验证，结果显示试验值（6.33%）与预测值（6.84%）相近，说明该试验模型模拟的结果准确可靠。傅里叶红外光谱和凝胶渗透色谱检测分析结果表明，在超声辅助提取过程中，红花黄色素提取液中大相对分子质量的物质发生降解，转化为小相对分子质量的物质，小相对分子质量的物质中酮类物质（如羟基红花黄色素A）受到的影响较小。超声辅助提取过程中产生的空化作用和机械作用可提高红花黄色素的提取速率，该方法可作为提高色素提取速率的辅助手段。稳定性试验结果表明，红花黄色素提取液应在中性且温度低于45 ℃的条件下避光保存。

提高植物染料色素的提取速率和提取得率是高效利用植物染料的前提。本研究中以去离子水为溶剂，采用超声辅助热水抽提的方法对红花黄色素进行提取，试验过程中未添加有机溶剂，从而减少了对环境的污染。这与李嘉欣等[25]的微波无溶剂萃取法在工艺上有相似之处，均实现了绿色高效提取的目的。为进一步提高红花黄色素的提取率，本研究中以水浴时间、水浴温度、超声功率为试验自变量，采用Box-Behnken 试验设计方法对提取工艺进行优化。使用Design-Expert 软件优化后的最佳工艺参数为水浴时间34 min、水浴温度90 ℃、超声功率350 W，在此条件下红花黄色素的提取率可达到6.84%，与孙燕雯等[26]优化的超声提取工艺相比，红花黄色素提取率有明显提高。傅里叶红外光谱和凝胶渗透色谱检测分析结果表明，超声辅助提取后红花黄色素提取液中酮类、羧基和羟基等官能团含量明显增加，而且数均相对分子质量由原来的311 Da 减小为220 Da，说明超声处理过程中产生的机械作用和空化作用能有效将大分子物质转化为小分子物质，促进红花黄色素的析出。这与Sharmila 等[21]在使用超声辅助提取蔷薇花花瓣黄色素试验中得出的结论一致。

由于试验条件限制，本研究中仅采用提取率作为响应值，评价标准过于单一，对于提取工艺的优劣性应进一步从多维角度进行评价与判断。另外，以去离子水作为主要提取溶剂，所得提取液的成分复杂，这给后续的分离纯化工作增加了难度。如何在保证绿色高效提取的同时又能得到相对纯净的色素成分是需进一步研究的问题。最后，植物染料虽有绿色环保、对人体具有保健作用等优点，但因上染率低、色牢度较差等因素，其在染色领域的应用不及合成染料，需进一步深入探究如何提高植物染料的附着率，使染料色素与基材纤维的结合更稳定。