HPLC法测定牡丹皮及不同市售丹皮酚软膏中丹皮酚的含量

张作华 潘德丽 李 珂

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

牡丹皮系毛茛科芍药属植物牡丹(PaenoinaSuffruticosaAndr)的根皮，性微寒，味苦，辛，归心、肝肾经，具有清热凉血，活血化瘀等功效[1]。丹皮酚是牡丹皮的主要化学成分之一，具有保肝、护肾、抗炎、镇定、降温、解热、镇痛、解痉等多种药理作用[2-4]。牡丹皮在全国大部分地区均产，如安徽、四川、湖南、湖北、陕西、山东、甘肃、贵州等地[5]。其中含有多种化学成分，如有机酸类、黄酮类、单萜及其苷类、三萜及其苷类、酚类及其酚苷类、挥发油等[6-8]。丹皮酚软膏的主要成分为丹皮酚，可用于皮肤各种湿疹、皮炎、皮肤瘙痒等各种皮肤疾病，具有抗过敏、消炎止痒等作用[9-10]。目前用于丹皮酚化学成分的测定方法较多，如高效液相色谱法[11]、气相色谱法[12]、紫外分光光度法[13]、薄层扫描法[14]等。本实验采用HPLC法对不同产地牡丹皮及不同厂家的丹皮酚软膏中丹皮酚进行含量测定，结果表明，该含量测定方法准确可靠，重复性好，可用于测定牡丹皮及丹皮酚软膏中丹皮酚的含量，也为牡丹皮及丹皮酚软膏的质量评价和临床应用提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-10AT vp plus溶剂输送泵(日本岛津公司)；SPD-10A vp plus紫外-可见光检测器(日本岛津公司)，TG凯特离心机(蓝城凯特实验仪器有限公司)，KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，GM-0.33A津腾隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)，FR224CN型电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)。0.22 μm微孔过滤膜(有机、水)(津腾)，丹皮酚标准品(110708-200505)，甲醇(色谱纯，天津市凯通化学试剂有限公司)，水(哇哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)，牡丹皮(山东170501；安徽1808001)，丹皮酚软膏厂家及批号见表1。

表1 丹皮酚软膏厂家及批号

1.2 对照品储备液的配制

精密称取丹皮酚的对照品5 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解，并将其定容至刻度线，摇匀，配制成质量浓度500 μg·mL-1的丹皮酚储备液，于4 ℃下进行保存。

1.3 牡丹皮供试品溶液的配制

将适量牡丹皮药材粉碎，精密称取牡丹皮粉末0.05 g，置于100 mL的容量瓶中，加甲醇溶液30 mL，超声处理20 min，振摇后静置冷却至室温后，用甲醇溶液稀释至刻度线，溶液充分混合后，利用TG凯特离心机超速离心5 min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.4 丹皮酚软膏供试液的配制

精密称取丹皮酚软膏0.025 g，加甲醇溶解后转移至25 mL的容量瓶，加入20 mL的甲醇溶液，进行超声处理，时间为15 min，自然冷却至室温后，用甲醇溶液稀释，震荡摇匀后，取适量溶液，用0.22 μm滤膜过滤，即得供试液。

2 方法与结果

2.1 色谱条件专属性考察

色谱柱：Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)︰水(B)=64︰36；流速：1 mL·min-1；检测波长：277 nm(图1)；在该色谱条件下，丹皮酚的对照品和供试品的色谱图分别如图2所示，丹皮酚的保留时间(tR)为6.882 min，其理论塔板数(N)为3 043，色谱图1所显示的峰形良好，供试品溶液中的杂质不干扰丹皮酚所形成的峰，专属性高。

图1 丹皮酚的光谱图

图2 丹皮酚HPLC色谱图(a.对照品；b.牡丹皮药材；c.丹皮酚软膏)

2.2线性关系的考察

精密量取丹皮酚的对照品储备溶液(浓度是500 μg·mL-1)各0.1、0.5、1、2、3 mL，分别置于10 mL的容量瓶，用甲醇溶液稀释至容量瓶的刻度线进行定容，摇匀，分别精密吸取定容后的溶液20 μL，依次注入到高效液相色谱仪中，在上述色谱条件下进行分析。记录色谱峰，以丹皮酚对照品溶液的浓度(μg·mL-1)为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，可得线性回归方程Y=88 035X+196 189(r=0.999 6)，表明丹皮酚在5～150 μg·mL-1范围线性关系良好。

2.3 精密度实验

取丹皮酚对照品储备液1 mL至50 mL的容量瓶中，震荡摇匀之后，得到浓度是10 μg·mL-1的溶液，精密吸取体积为20 μL的溶液，注入到高效液相色谱仪中，重复分析6次，记录在277 nm处丹皮酚的色谱图，以峰面积计算，RSD为0.690%，表明该方法的精密度良好。

2.4 稳定性实验

取批号为170501的牡丹皮粉末0.05 g，放入10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度线，摇匀，用超声仪处理20 min，自然冷却到室温，用超速离心仪处理，取上清溶液，将样品于0、2、4、8、12 h，分别精密吸取20 μL，依次注入液相色谱仪。记录丹皮酚的峰面积，算得RSD为0.730%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5 重复性实验

取批号为170501的牡丹皮粉末，分别进行精密称取6份，每份的质量为0.05 g，转移至10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释到刻度线，摇匀，超声处理20 min，自然冷却到室温，离心处理10 min，取上清液。分别精密吸取20 μL，依次注入到高效液相色谱仪，得到RSD为1.903%，表明供试品溶液重复性较好。

2.6 加样回收率实验

称取批号为170501的牡丹皮粉末0.60 g，置于100 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度线，震荡摇匀，超声处理20 min，自然冷却到室温，用甲醇溶液定容到容量瓶的刻度线，用超速离心仪处理10 min，取其上清液，将其作为供试品溶液a，精密吸取20 μL，记录峰面积，得其浓度(122.41 μg/mL)。取丹皮酚对照品，分为低、中、高浓度(0.5、0.6、0.7 mg·mL-1)3组，每组分为3份，精密量取1 mL置于10 mL的容量瓶之中，并加入供试品溶液a，量取5 mL，用甲醇溶液稀释至刻度，进行摇匀和过滤，然后分别精密吸取20 μL，注入到液相色谱仪，记录峰面积，其结果见表2，低、中、高3个浓度的RSD为0.84%，0.76%，0.75%，表明该方法的准确度较高。

表2 丹皮酚的加样回收率

2.7 样品的含量测定

取2批牡丹皮药材粉碎处理之后，精密称取0.025 g，置于25 mL的容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度线，摇匀，超声处理20 min，自然冷却至室温之后，用甲醇溶液补足到刻度线。超速离心5 min，吸取上清溶液，用滤头过滤，分别注入液相色谱仪中。另外取7批不同厂家的丹皮酚软膏，精密称取0.025 g，置于25 mL的容量瓶之中，用甲醇溶液稀释至刻度，超声溶解15 min，自然冷却至室温，用甲醇溶液补足至刻度线，用0.22 μm滤膜过滤，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，带入标准曲线计算含量，结果见表3，4。

表3 牡丹皮中丹皮酚的含量

表4 丹皮酚软膏中丹皮酚的含量

3 讨 论

3.1 流动相和柱温

通过前期实验条件探索过程中发现，流动相中甲醇含量增加，流速加大和柱温升高，均能明显的缩短各组分的保留时间(Rt)。经过反复的实验探索比较，以流动相：甲醇-水(64︰36)，流速：1 mL·min-1，室温(22～25 ℃)条件下，样品供试液中丹皮酚峰与其他组分均能达到基线分离且能节约实验时间和药品的使用量。

3.2 检测波长的选择

丹皮酚的最大吸收波长为215.6 nm，其次是277.2 nm，由于供试液中含有其它成分，在215.6 nm处为末端吸收，干扰峰较多，分离效果差。所以选择在277.2 nm附近，在试验过程中丹皮酚在277 nm处目标色谱峰和其他干扰峰完全分离，互相不扰，且分离时间短，所以本实验选择波长277 nm。

3.3 牡丹皮超声提取时间的选择

用甲醇试剂溶解药品，超声仪超声提取牡丹皮药材中丹皮酚，方法简便易行且提取率高，经比较不同超声提取时间的结果表明，超声提取20 min，丹皮酚已基本提取完全。

3.4 样品供试液制备方法的选择

有文献报道牡丹皮中丹皮酚含量的提取主要采用水蒸气蒸馏法、CO2超临界流体萃取法、溶剂提取法等实验方法[15-16]。经过比较分析，CO2超临界流体萃取法能选择性地从牡丹皮药材中提取丹皮酚而不破坏丹皮酚的化学结构，进而不影响丹皮酚的质量，并且CO2易回收，对于环境几乎没有影响，操作成本相对较低，但是其提取的装置价格昂贵，对于大规模提取十分不利；水蒸气蒸馏法虽然操作也简单、成本低，但所需时间较长没有采用；溶剂提取法提取率较高，并且操作方便，对于本次试验来说比较合适。