柚皮苷调控PI3K/Akt/eNOS通路控制2型糖尿病大鼠脑血管内皮氧化损伤的作用探讨

郭芬，王晓雪

作者单位：河南大学第一附属医院，a老年科，b老年神经内科，河南 开封475000

活性氧（ROS）过量生成可增加糖尿病相关血管并发疾病的发生风险。柚皮苷（Naringin）具有抗氧化、清除自由基的特性。此外，柚皮苷具有抗炎、抗凋亡、抗癌和心脏保护作用。最近，有研究报道，柚皮苷（Naringin）对糖尿病及其潜在并发症具有一定的治疗作用。柚皮苷的作用机制涉及抑制炎症、氧化应激损伤、糖代谢酶异常等方面，并且可在一定程度上延缓糖尿病并发症的发生发展。然而，柚皮苷在治疗2型糖尿病方面的分子机制仍有待阐明。

3-磷酸肌醇激酶（PI3K）是肌醇与磷脂酰肌醇的重要激酶，PI3K 家族成员属于原癌基因。在PI3K家族中，PI3K 可通过与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用导致二聚体构象改变而被激活。PI3K激活后可以磷酸化蛋白激酶B（AKT）并导致Akt 信号通路激活。Akt 信号通路激活后可磷酸化内皮型一氧化氮（eNOS）并调节eNOS 活性。eNOS 的活化可进一步促进一氧化氮（NO）的释放并发挥血管保护作用。因此，PI3K/Akt/eNOS 信号通路在2 型糖尿病发病过程中，尤其是在血管内皮氧化损伤方面，具有重要作用。因此，2019年3月15 日至2020年5月20 日，本研究旨在探讨柚皮苷对2型糖尿病大鼠脑血管内皮氧化损伤的影响。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1 材料与方法

1.1 实验材料

将80只6周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量范围120～150 g，购自南京医科大学实验动物中心，许可证号SYXK（豫）2019-0002，饲养在25 ℃、55%湿度、照明条件为12 h光暗循环的环境中。

1.2 动物分组及建模

将大鼠按随机字母表法分为对照组、模型组、柚皮苷组、柚皮苷+LY294002 组（n=20）。对照组大鼠给予标准饲料，其他组大鼠给予高糖高脂饲料（20%蔗糖、10%猪油和2.5%蛋黄），共喂养4周。禁食12 h后，对模型组、柚皮苷组和柚皮苷+LY294002组大鼠腹腔注射60 mg/kg 的链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司）建立2 型糖尿病模型；对照组大鼠注射等体积的生理盐水。1 周后收集大鼠尾静脉血并测空腹血糖值（FBG），FBG＞16.7 mmol/L 且伴有多饮、多食、多尿、胰岛素水平升高则表示造模成功。各组大鼠继续喂养8周，柚皮苷组大鼠灌胃100 mg/kg 的柚皮苷溶液，柚皮苷+LY294002 组大鼠在灌胃100 mg/kg 的柚皮苷溶液的基础上，加用腹腔注射给予100 mg/kg 的PI3K 抑制剂LY294002[凯梅根（上海）生物科技有限公司］，其他组大鼠灌胃等体积的生理盐水。

1.3 标本收集

收集大鼠血清用于检测血糖、血脂水平。麻醉大鼠（10%水合氯醛）并取出脑组织，一部分脑组织以液氮固定4 h，并在-80 ℃冷藏，用于氧化损伤相关指标检测及Western blotting，另一部分常规制作切片，用于HE染色。

1.4 生化指标检测

强生稳步倍加型血糖仪检测大鼠血糖水平。日立7600 全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。采用硝酸还原酶法检测各组大鼠血清NO 水平，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5 苏木精

-

伊红（HE）染色

使用切片机对大鼠脑组织进行切片，按照试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）说明对脑组织进行HE染色。

1.6 氧化应激指标的检测

将各组大鼠脑组织进行匀浆，按照南京建成生物工程研究所的试剂盒测定丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。

1.7 蛋白质印迹法（Western blotting）

将大鼠脑组织裂解，通过BCA法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE上分离蛋白，并转移至PVDF膜[伯乐生命医学产品（上海）有限公司］，5%脱脂牛奶（完达山乳业股份有限公司）封闭1 h。将膜在4 ℃下与以下一抗过夜孵育：3-磷酸肌醇激酶（PI3K）、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化-AKT（p-AKT）内皮型一氧化氮（eNOS）、磷酸化-eNOS（p-eNOS）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1∶1 000）。抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。将膜在室温下与山羊抗兔二抗（美国Bio-world 公司，1∶3 000）孵育1 h。通过超敏ECL化学发光试剂盒显影。GAPDH作为内部对照。

2 结果

2.1 柚皮苷对2 型糖尿病大鼠血糖和血脂代谢指标的影响

与模型组比较，柚皮苷组的空腹血糖、TC、TG 和LDL-C 水平均显著降低，而HDL-C 水平显著升高。与柚皮苷组比较，柚皮苷+LY294002 组的空腹血糖、TC、TG 和LDL-C 水平均显著升高，而HDL-C水平显著降低。见表1。

表1 SD大鼠80例的血糖和血脂代谢指标水平/（mmol/L，±s）

2.2 柚皮苷对2 型糖尿病大鼠脑组织病理变化的影响

对照组大鼠脑皮层区神经元细胞形态完整，海马齿状回细胞排列整齐。模型组大鼠大脑皮层区发生明显的神经元变性、坏死，海马齿状回神经细胞核固缩、深染、变形、细胞排列紊乱。柚皮苷组的上述组织病理改变均明显减轻。而柚皮苷+LY294002 组的神经元细胞变性、核固缩、细胞排列紊乱等病变较柚皮苷组加重。见图1。

图1 2型糖尿病大鼠脑组织病理变化比较（HE染色×200）

2.3 柚皮苷对2 型糖尿病大鼠血清一氧化氮（NO）水平的影响

与对照组比较（34.54±2.65）μmol/L，模型组大鼠的血清NO 水平（19.11±1.47）μmol/L 显著降低（

t

=21.743，

P

=0.001）。与模型组比较，柚皮苷组的血清NO 水平（28.76±2.21）μmol/L 显著升高（

t

=17.332，

P

=0.003）。然而，与柚皮苷组比较，柚皮苷+LY294002 组的血清NO 水平（24.19±1.86）μmol/L显著降低（

t

=11.421，

P

=0.012）。

2.4 柚皮苷对2 型糖尿病大鼠脑组织氧化应激指标的影响

与对照组比较，模型组大鼠的SOD 水平显著降低[（63.54±4.88）U/mgprot 比（41.22±3.17）U/mgprot，

t

=14.378，

P

=0.004］，而MDA 水平显著升高；对照组MDA 低于模型组[（4.13±0.31）nmol/mgprot比（9.37±0.72）nmol/mgprot，

t

=27.322，

P

=0.001］。与模型组比较，柚皮苷组的SOD 水平为（55.17±4.24）U/mgprot 显著升高（

t

=12.489，

P

=0.008），而MDA 水平为（6.28±0.48）nmol/mgprot 显著降低（

t

=18.997，

P

=0.001）。然而，与柚皮苷组比较，柚皮苷+LY294002组的SOD 水平（46.89±3.60）U/mgprot 显著降低（

t

=21.545，

P

=0.011），而MDA 水平（7.15±0.55）nmol/mgprot显著升高（

t

=15.224，

P

=0.017）。

2.5 柚皮苷对2 型糖尿病大鼠脑组织PI3K/Akt/eNOS 信号通路的影响

与模型组比较，柚皮苷组的PI3K、p-Akt 和p-eNOS 水平显著升高，与柚皮苷组比较，柚皮苷+LY294002 组的PI3K、p-Akt 和peNOS 水平显著降低。见表2，图2。

图2 Western blotting检测各组大鼠脑组织相关表达：A为PI3K，B为Akt，C为eNOS的

3 讨论

据报道，高葡萄糖导致血管内皮细胞中过量生成活性氧（ROS）。过量的ROS形成影响缺氧信号通路并进一步加重血管内皮障碍。柚皮苷具有抗癌、抗炎、抗氧化及其他多种生物活性。应用不同剂量的柚皮苷（20、40 和80 mg/kg）治疗糖尿病大鼠，发现柚皮苷以剂量依赖性方式显著减少糖基化血红蛋白并改善胰岛素分泌，表明柚皮苷具有剂量依赖性降血糖作用。在柚皮苷和维生素C联合治疗STZ 诱导的Wistar 大鼠过程中，有研究者发现该治疗有效地改善了血糖和糖基化血红蛋白，增加了肝脏和肾脏己糖激酶活性，减少了葡萄糖6 磷酸酶和果糖16-二磷酸活性，减少脂质过氧化物的堆积，并增加了谷胱甘肽的合成。Ali等报道柚皮苷治疗STZ 诱导大鼠可显著降低血糖、过氧化氢和硫代巴比妥酸水平，同时增加胰岛素水平和抗氧化酶活性，从而导致抗氧化能力的总体提高。因此，柚皮苷的抗高血糖作用和抗氧化应激作用可能在治疗糖尿病及相关并发症方面具有较高价值。本研究证实了柚皮苷的良好的抗氧化作用。

表2 各组大鼠脑组织中PI3K、p-AKT/total-AKT和p-eNOS/total-eNOS的蛋白相对表达量

研究表明，血管内皮细胞可分泌多种血管活性物质，其中包括血管舒张因子NO。研究显示，糖尿病患者因发生血管内皮功能受损可导致NO 合成被抑制。此外，高血糖条件可导致内皮细胞功能显著降低，并降低NO 生物利用度。此外，高血糖培养条件会加速血管内皮细胞衰老，导致增殖活性受损。本研究发现，模型组大鼠的血清NO 水平显著降低，而柚皮苷治疗显著升高了大鼠血清NO水平。提示，柚皮苷的治疗作用可能与调节NO 的合成和分泌有关。

其他研究者发现，PI3K/AKT/eNOS 信号通路受到抑制可引起血管内皮细胞功能紊乱，当eNOS 活性下降时，导致NO 合成减少。eNOS 活性的增强主要由PI3K/AKT 信号通路介导。本研究发现，柚皮苷治疗显著上调了PI3K 的表达并激活了PI3K/AKT/eNOS 信号通路，因此柚皮苷发挥了PI3K激动剂的作用。为了确定PI3K/AKT/eNOS 信号通路在柚皮苷治疗过程中的作用，本研究设置了柚皮苷+LY294002 组，该组大鼠在柚皮苷基础上应用PI3K 抑制剂LY294002 处理大鼠，发现LY294002 处理抑制了PI3K/AKT/eNOS 信号通路，并且可明显减弱柚皮苷对2型糖尿病大鼠的治疗作用。

综上所述，柚皮苷对2 型糖尿病大鼠的脑保护作用主要由PI3K/AKT/eNOS信号通路介导。