大黄素上调微小RNA-206减轻缺氧诱导的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞损伤

吴坤，张建刚，孙科，朱金钊

作者单位：安阳市人民医院神经内科，河南 安阳455000

缺氧（hypoxia）可导致机体器官功能障碍，诱导很多病理过程的发生，如氧化应激、炎症等。缺氧性脑病是一个严重的临床问题，造成许多病人的运动障碍、认知功能障碍和死亡。从干燥根茎和虎杖根中提取的大黄素（Emodin）具有抗氧化作用和抗肿瘤作用。越来越多的证据表明，大黄素具有神经保护作用，可以减少活性氧、白细胞介素-8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白1的产生来防止动脉粥样硬化斑块的形成。但是，大黄素在神经损伤中的保护作用的机制尚未十分清楚。微小RNA（miRNA）指一组长度为21～25 nt 的非编码RNA，它通过调节特定基因参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化和代谢。研究表明，miRNA在多种类型的疾病中异常表达，包括心脏病、炎性疾病和癌症。微小RNA-206（miR-206）在神经损伤病人中的表达水平出现异常，其是否参与大黄素的作用机制尚未清晰。于2018年6月至2019年6月，以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞为对象，进行本研究，旨在探索大黄保护缺氧诱导神经损伤的功能机制与miR-206的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

PC12细胞购自上海中科院细胞库；大黄素购自Sigma 公司；二甲基亚砜（DMSO）购自上海钰博生物科技有限公司；兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）单克隆抗体购自碧云天；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自Abbkine；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45μm）购自Millipore公司；膜联蛋白/异硫氰酸荧光素-碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒购自Solarbio；丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；活性氧（ROS）检测试剂盒、肿瘤坏死因子α（TNF-α）检测试剂盒、人白细胞介素-1β（IL-1β）检测试剂盒购自北京中生北控公司；RNA 试剂盒、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞的培养 用10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）培养基培养PC12细胞，用细胞培养箱进行37 ℃、5%二氧化碳的条件下培养传代。

1.2.2

细胞的分组与处理 将正常培养的PC12细胞标记为对照（NC）组；参照张开明的方法将气体调至1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气进行缺氧处理，用大鼠神经生长因子NGF处理2 h再置于气体中培养，以此法建立缺氧PC12 细胞，将其标记为hypoxia 组。将0.1%DMSO处理的缺氧PC细胞标记为DMSO组。用0.1%的DMSO稀释大黄素Emodin（2、4、6 μg/mL），然后处理hypoxia组细胞48 h，分别标记为hypoxia+2 μg/mL Emodin组、hypoxia+4 μg/mL Emodin组、hypoxia+6 μg/mL Emodin组，从中筛选最适浓度组hypoxia+4 μg/mL Emodin组，将其标记为hypoxia+Emodin组。用脂质体法，取4倍量的脂质体与DNA混合，将miRNA阴性对照（miR-con）、miR-206、4 μg/mL Emodin+抗-miRcon（anti-miR-con）、4 μg/mL Emodin+抗-miR-206（antimiR-206）转染至hypoxia组细胞，转染4 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，用qRT-PCR检测转染的效率，将转染成功的组标记为hypoxia+miR-con 组、hypoxia+miR-206组、hypoxia+Emodin+anti-miR-con组、hypoxia+Emodin+anti-miR-206组。

1.2.3

Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 收集细胞，用结合缓冲液重悬细胞，然后取500 μL细胞加入离心管，再取5 μL的Annexin V-/FITC，避光反应15 min，结束后再加入5 μL的PI，避光反应10 min，迅速上流式细胞仪进行检测分析。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次，实验重复3次。

1.2.4

Western blotting 检测细胞中Cleaved-caspase-3 的蛋白表达 收集细胞，用裂解液裂解后提取总蛋白，并进行蛋白定量，再用上样缓冲液混悬细胞后进行沸水浴变性10 min，取上清进行蛋白电泳上样。电泳结束后，用转膜仪将蛋白从胶上转移至PVDF膜上，转磨过程要在4 ℃冰箱中完成。结束后，用5%脱脂奶粉进行封闭，然后将膜转移至稀释好的一抗溶液中，4 ℃冰箱中孵育过夜。取出膜，将其转移至二抗稀释液中，室温孵育2 h，洗膜。用ECL 发光液进行曝光，然后用Image J 分析条带的灰度值，以β-actin 为内参，以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

1.2.5

ELISA 实验检测细胞中MDA、SOD、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量 检测细胞上清液中MDA、SOD、ROS、TNF-α、IL-1β的含量。

1.2.6

qRT-PCR 法检测细胞中miR-206 mRNA 的表达 收集细胞，用RNA 抽提试剂盒提取细胞的总RNA，再用反转录试剂盒进行cDNA 的合成。用qRT-PCR 试剂盒按照94 ℃变性2 min；然后94 ℃，30 min；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s 进行循环扩增，后延伸温度72 ℃，2 min，45 个循环的条件进行扩增，以U6为内参，2法计算miR-206 mRNA 表 达。miR-206 的正向引物为5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'，反向引物为 5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'。 U6的正向引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物为 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2 结果

2.1 不同浓度Emodin 对缺氧处理的PC12 凋亡的影响

与NC 组（4.29±0.43）%相比，0.1%DMSO 组细胞中的凋亡率（4.37±0.44）%差异无统计学意义（

P

＞0.05），见图1。与NC 组相比，hypoxia 组细胞凋亡率显著升高，Cleaved-caspase-3 蛋白表达量显著升高，与hypoxia 组相比，hypoxia+2 μg/mL Emodin 组、hypoxia+4 μg/mL Emodin 组、hypoxia+6 μg/mL Emodin组细胞凋亡率均显著降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表达量显著降低（

P

＜0.001）。见表1、图2、图3。

表1 不同浓度Emodin对缺氧处理的PC12凋亡的影响（重复次数=3，n=9）/±s

图3 不同浓度Emodin的条件下Western blotting检测Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.2 Emodin 对缺氧处理的PC12 氧化应激和炎症反应的影响

与NC 组相比，hypoxia 组细胞MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均显著升高，SOD 的含量显著降低，与hypoxia 组相比，Hypoxia+Emodin 组细胞MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均显著降低，SOD的含量显著升高（

P

＜0.001），见表2。

2.3 Emodin 对miR

-

206 表

达

的

影

响

与NC 组（1.00±0.12）相比，hypoxia 组细胞miR-206 的表达量（1.00±0.12）显著降低，与hypoxia 组（0.30±0.03）相比，Hypoxia+Emodin 组 细 胞miR-206 的 表 达 量（0.90±0.09）显著升高（

P

＜0.001）。

2.4 高表达miR

-

206对hypoxia处理的PC12凋亡，氧化应激和炎症反应的影响

与NC组相比，hypoxia组细胞miR-206 的表达量（显著降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表达显著升高，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量均显著升高，SOD的含量显著降低，细胞凋亡率显著升高；与hypoxia+miR-con 组相比，hypoxia+miR-206组细胞miR-206的表达量显著升高，Cleavedcaspase-3蛋白表达显著降低，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量均显著降低，SOD的含量显著升高，细胞凋亡率显著降低（

P

＜0.001）。见表3、图4。

图4 高表达miR-206条件下Western blotting检测Cleaved-caspase-3表达

2.5 低表达miR

-

206可以减轻Emodin 对缺氧处理的PC12 凋亡，氧化应激和炎症反应的影响

与hypoxia 组相比，hypoxia+ Emodin 组细胞中miR-206 的表达量显著升高，Cleaved-caspase-3 蛋白表达显著降低，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均显著降低，SOD 的含量显著升高，细胞凋亡率显著降低；与hypoxia+ Emodin 组 相 比，hypoxia+ Emodin+anti-miR-206 组细胞中miR-206 的表达量显著降低，Cleavedcaspase-3蛋白表达显著升高，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均显著升高，SOD 的含量显著降低，细胞凋亡率显著升高（

P

＜0.001）。见图5、表4。

图5 低表达miR-206条件下Western blotting检测Cleaved-caspase-3表达

3 讨论

表2 Emodin对缺氧处理的PC12中MDA、SOD、ROS活性和TNF-α、IL-1β含量的影响（重复次数=3，n=9）/±s

表3 高表达miR-206对hypoxia处理的PC12凋亡，氧化应激和炎症反应的影响（重复次数=3，n=9）/±s

表4 低表达miR-206可以减轻Emodin对缺氧处理的PC12凋亡，氧化应激和炎症反应的影响（重复次数=3，n=9）/±s

大黄素是一种提取自干燥根茎和虎杖根的提取物，可以保护神经元免受缺氧缺血脑损伤。Guo等发现，在缺血缺氧环境下培养的神经元样细胞的活力降低，而细胞中激活素A和caspase-3的表达增加，大黄素处理后提高了缺氧葡萄糖的神经元样细胞的存活率，增加了激活素A的表达，并降低了caspase-3的表达，表明大黄素可通过激活素A信号通路抑制神经元凋亡并减轻神经细胞的损伤。曾欢欢等在研究中发现，大黄素治疗后，大鼠的自噬小体融合减轻，脊髓神经纤维脱髓鞘明显减轻，炎性因子TNF-α、IL-6明显降低，Nrf2-ARE信号通路活性明显升高，揭示大黄素发挥神经损伤保护作用的机制与Nrf2-ARE信号通路的活化程度紧密相关。本研究建立了NGF诱导的PC12细胞损伤模型，用流式细胞术检测大黄素处理的受损细胞的凋亡率，发现大黄素可呈浓度依赖性抑制细胞的凋亡，并下调Cleaved-caspase-3表达，进一步用ELISA实验检测细胞中氧化应激因子MDA、SOD、ROS和炎性因子TNF-α、IL-1β的含量，发现大黄素可下调细胞中MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量，上调SOD的含量，说明大黄素具有明显的抗氧化应激、抗炎作用，这些实验结果均与前人的研究结果相吻合，再次证实了大黄素在神经损伤疾病中的保护作用。通过qRTPCR法检测细胞中miR-206的表达，发现大黄素可恢复缺氧诱导的PC12细胞中miR-206的下调，由此推测大黄素在神经损伤中的保护作用机制可能与miR-206的表达水平具有相关性。不足之处在于，这个结果未在动物实验中进行进一步的验证。

miRNA在神经疾病中起着至关重要的作用。在缺氧缺血性脑损伤（HIBD）引起的海马神经元中，miR-592-5p水平降低。miR-592-5p模拟物给药通过靶向前列腺素DP受体（PTGDR）来预防HIBD引起的海马神经元损伤。脑室内注射miR-126-3p模拟物通过抑制脑血管内皮细胞中的PIK3R2和Akt信号通路来减轻血脑屏障破坏、脑水肿和神经元损伤。Xu等在神经性疼痛的研究中通过微阵列分析、qRTPCR法分析miRNA表达谱发现，miR-206是其中表达异常降低的5个miRNA之一，说明血清中miRNA是神经性疼痛的潜在预测因子。Wen等在研究中报道，miR-206-3p在慢性坐骨神经损伤大鼠的背根神经节中降低，上调miR-206-3p可以缓解神经性疼痛并降低组蛋白脱乙酰基酶4（HDAC4，miR-206-3p 的预期靶标）水平，HDAC4的过表达可减弱miR-206-3p对神经性疼痛的作用，显示，miR-206-3p-HDAC4信号通路在慢性坐骨神经损伤诱发的神经性疼痛中具有潜在的重要作用。Sun等发现，miR-206在慢性收缩性损伤的大鼠背根神经节损伤中的表达水平异常下调，过表达miR-206后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平降低，以时间依赖性方式减轻慢性收缩性损伤大鼠的机械性异常疼痛和热痛觉过敏，这提示miR-206可能充当神经性疼痛治疗的潜在靶标。本研究通过qRT-PCR法检测了NGF诱导的PC12损伤细胞中miR-206的表达发现，其中miR-206异常降低，氧化应激水平明显升高，炎性水平明显升高，细胞凋亡率显著升高，过表达miR-206后，能够明显的减轻NGF诱导的PC12 细胞的上述损伤，这个结果揭示了miR-206 对NGF诱导的PC12细胞具有抗氧化应激、抗炎和抗凋亡功能，提示miR-206在缺氧诱导的神经损伤中的潜在治疗价值。深入研究发现，抑制miR-206明显地减弱大黄素对缺氧诱导的PC12细胞损伤的保护作用，这更说明大黄素在神经损伤中的保护作用的机制与上调miR-206的表达具有明显相关性，两者具有协同作用。

综上所述，大黄素对缺氧诱导的神经损伤具有抗氧化应激、抗炎和抗凋亡的作用，其机制与协同miR-206相关。这个实验结果为中药的功能机制的探索开辟了新道路，也为大黄素在神经损伤疾病中的治疗价值研究奠定基础。