基于RT-PCR检测对6个香味葡萄品种感染病毒状况的分析*

李 晨，范旭东，张尊平，胡国君，任 芳，张宝东，董雅凤

（中国农业科学院果树研究所，国家落叶果树脱毒中心，辽宁兴城 125100）

葡萄作为重要的经济作物，在果树产业中有重要的地位。我国鲜食葡萄种植面积多年来一直处于世界第一（OIV.2020）。根据中国统计年鉴2019年统计，我国葡萄栽培主要集中于新疆、河北、山东、云南、辽宁、河南、江苏、浙江、陕西、广西等地。香气是葡萄的重要感官和品质指标，是评价优良葡萄种质资源的关键因素之一。近年来，随着消费者对多元化品种的需求，一些香味葡萄品种也因其独特的感官品质备受人们追捧，‘巨峰’‘玫瑰香’‘夏黑’‘阳光玫瑰’等葡萄品种大面积发展，尤其是近2年‘阳光玫瑰’成为热门品种[1]。

葡萄是感染病毒最多的果树，目前，国内外已报道的葡萄病毒病病原种类有80多种[2]，我国至今报道了18种[3-17]。病毒病害的发生严重影响葡萄的产量和品质。如‘夏黑’感染病毒之后，果实色泽暗淡，易萎蔫失水，风味寡淡，果实含糖量显著降低，含酸量和总酚含量增加，导致果皮变涩，芳香物质成分改变，严重影响了果实品质[18]。葡萄一旦感染病毒，很难彻底根除，并且易通过嫁接或修剪传染[19]。目前，我国大部分产区葡萄种植户在栽培技术标准化方面已经大幅度提升，明显从追求产量转变为追求质量[1]。葡萄病毒病是制约香味葡萄栽培效益提高的重要因素，明确我国香味葡萄品种携带病毒的情况对于病毒病防控具有重要意义。

2018—2019年，笔者采用RT-PCR方法对来自13个省（市、自治区）的6个香味葡萄品种的212个样品进行了14种葡萄病毒的检测，包括葡萄卷叶相关病毒1、2、3、4、7（grapevine leafroll-associated virus，GLRaV-1,2,3,4,7）、沙地葡萄茎痘相关病毒（grapevine rupestris stem pitting -associated virus,GRSPaV）、葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus,GFLV）、葡萄斑点病毒（grapevine fleck virus,GFkV）、葡萄病毒A（grapevine virus A,GVA）、葡萄病毒B（grapevine virus B,GVB）、葡萄病毒E（grapevine virus E,GVE）、灰比诺葡萄病毒（grapevine pinot gris virus,GPGV）、葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus,GINV）和葡萄蚕豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus,GFabV），初步明确了我国6个香味葡萄品种的带毒状况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018—2019年采集来自我国13个省（市、自治区）的6个香味葡萄品种的样品212个，其中包括59个‘阳光玫瑰’样品（来源于安徽、福建、广西、河南、江苏、辽宁、山东、上海、云南）、31个‘玫瑰香’样品（来源于北京、河北、辽宁、天津、浙江）、47个‘巨峰’样品（来源于安徽、广西、河北、江苏、辽宁、山东、上海、四川、浙江）、30个‘夏黑’样品（来源于山东、上海、江苏、云南、广西、安徽）、22个‘水晶葡萄’样品（来源于贵州）、23个‘着色香’样品（来源于辽宁和吉林）。

1.2 试验方法

1.2.1RNA提取及cDNA合成

采用柱式提取方法[20]进行总RNA的提取。反转录在1.5 mL灭菌离心管中进行，依次加入灭菌纯水20.0 μL、50 μmol/L六碱基随机引物（上海生工生物工程技术服务公司合成）2.0 μL，总RNA 8.0 μL，离心混匀，72 ℃保温10 min，冰上放置2 min；加入5×M-MLV buffer 10.0 μL、10 mmol/L dNTPs 2.5 μL、200 U/mL M-MLV逆转录酶1 μL、灭菌纯水6.5 μL，离心混匀，37 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，70 ℃5 min。合成的cDNA立即用于PCR扩增或置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2PCR扩增

根据已报道的14种葡萄病毒序列合成特异性引物[21]，以cDNA为模板分别进行PCR扩增，扩增体系为：cDNA2.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.2 μL，DEPC H2O补足总体积至25 μL。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR扩增均设阴性和阳性对照，其中，GFLV检测需采用巢氏PCR方法[21]，进行第二轮扩增。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测结果

由表1、图1可知，59个‘阳光玫瑰’葡萄样品中带毒样品55个，带毒株率93.22%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE、GFabV、GLRaV-1、GLRaV-4和GFLV共13种病毒，检出率3.39%～66.10%；31个‘玫瑰香’葡萄样品中带毒样品21个，带毒株率67.74%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE和GFLV共10种病毒，检出率3.23%～38.71%；47个‘巨峰’葡萄样品中带毒样品39个，带毒株率82.98%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GPGV、GVA、GINV、GLRaV-2、GVB、GVE和GLRaV-4共10种病毒，检出率2.13%～70.21%；30个‘夏黑’葡萄样品中带毒样品19个，带毒株率63.33%，检测到GRSPaV、GFkV、GLRaV-3、GVA、GLRaV-2、GVE、GFabV和GFLV共8种病毒，检出率3.33%～40.00%；22个‘水晶葡萄’样品中带毒样品6个，带毒株率27.27%，检测到GVA、GLRaV-2和GVE共3种病毒，检出率4.55%～22.73%；23个‘着色香’葡萄样品中带毒样品10个，带毒株率43.48%，检测到GRSPaV、GFkV和GLRaV-2共3种病毒，检出率17.39%～26.09%。所有样品均未检测到GLRaV-7。

表1 6个香味葡萄品种的病毒检测结果

图1 葡萄病毒在212个样品中的分布情况

2.2 病毒在不同地区及复合侵染的发生情况

对212个葡萄样品检测结果进行统计分析的结果显示，来源于不同地区的同一品种的带病毒情况存在差异性（表2）。来自福建、广西、河南、云南、江苏、安徽等地的‘阳光玫瑰’样品带毒率均达100.00%，来自上海的样品未检测到葡萄病毒；除来自浙江的‘玫瑰香’外，其他地区的‘玫瑰香’样品以及来自各地的‘巨峰’和‘夏黑’样品中均能检测到葡萄病毒，且带毒率较高；来自辽宁的‘着色香’和贵州的‘水晶葡萄’样品带毒率分别为10.00%和27.27%。

表2 不同地区6个香味葡萄品种病毒侵染情况

病毒复合侵染在6个香味葡萄品种中普遍发生（表3）。‘阳光玫瑰’以2～5种病毒复合侵染为主，其中2种病毒复合侵染率为25.42%，3种病毒复合侵染率为10.17%。‘玫瑰香’以3种病毒复合侵染为主，复合侵染率为29.03%。‘巨峰’和‘夏黑’以2～4种病毒复合侵染为主，复合侵染率分别为10.64%～21.28%和6.67%～10.00%。‘水晶葡萄’和‘着色香’主要为2～3种病毒复合侵染，复合侵染率分别为9.09%和8.70%。

表3 6个香味葡萄品种病毒复合侵染情况

3 讨论与结论

本研究发现，葡萄病毒在6个香味品种中发生普遍，其中分布较广的有GRSPaV、GFkV、GLRaV-3以及近几年新报道的GPGV和GINV；检测结果显示，玫瑰香型的‘阳光玫瑰’和草莓香型的‘巨峰’‘夏黑’以GRSPaV、GFkV、GLRaV-3侵染居多，近几年报道的GPGV、GINV、GFabV在我国主栽香味葡萄品种中侵染率也较高，例如，玫瑰香型的‘玫瑰香’葡萄以GPGV（38.71%）侵染为主。因此，香味品种中新病毒的发生和危害需引起高度重视，同时，有必要加强新病毒的传播途径研究，从而为其防控提供依据。

近年来，香味葡萄品种栽培面积迅速扩大，苗木生产量大、流通频繁，极大地增加了葡萄病毒感染几率[22]。‘阳光玫瑰’‘玫瑰香’‘巨峰’和‘夏黑’栽植范围广，来自各地的样品大部分检测到葡萄病毒，而‘水晶葡萄’和‘着色香’主要分布于贵州及辽宁，样品带毒率相对较低。葡萄病毒复合侵染是一种常见现象，有研究表明，复合感染葡萄卷叶病毒及GVA的植株，危害会加剧[23]，通常复合侵染严重的植株病症表现明显，果实品质下降，严重时可致树体死亡[24]，给葡萄产业带来极大威胁。对6个香味品种的病毒检测结果统计后发现，在‘阳光玫瑰’‘巨峰’和‘玫瑰香’上2种及以上葡萄病毒复合侵染现象更普遍，复合侵染率达86.42%、51.08%、48.39%，复合侵染的组合方式有多种，其中‘阳光玫瑰’单个样品中最多检测出9种病毒，以GRSPaV、GFkV和GLRaV-3与其他葡萄病毒组合的复合侵染比例最高，而‘玫瑰香’则以GPGV和GINV与其他葡萄病毒组合居多。‘水晶葡萄’与‘着色香’葡萄病毒复合侵染现象不突出，可能与其地域性栽培和扦插繁殖使病毒传播和累积受限有关。分析结果还发现，GRSPaV+GFkV+GLRaV-3以及GPGV+GINV的复合侵染率较高，是否与这几种病毒的传播途径有关，有待进一步研究。

本研究初步明确了‘阳光玫瑰’‘巨峰’‘夏黑’‘玫瑰香’‘着色香’‘水晶葡萄’等6个香味葡萄品种的病毒种类及侵染状况，为其引种栽培、病毒早期检测及病毒病防控提供了依据。