环状RNA在胃癌研究中的意义*

曹 萱，张 徐 综述，蒋鹏程 审校

(1.江苏大学附属人民医院普外科，江苏镇江 212002；2.江苏大学医学院，江苏镇江 212000)

1 环状RNA(circRNA)的背景

circRNA最初是在植物病毒中被发现[1]，由于其是共价闭合且无5′帽子结构和3′末端poly(A)尾巴的环状结构，加之当时的技术限制，一直被认为是错误拼接的产物[2]。随着高通量RNA测序(RNA-seq)技术和生物信息学分析的发展和应用，科学家们检测出越来越多的circRNA，同时发现其参与了多种疾病的发生发展，特别是在恶性肿瘤领域。

2 circRNA的类型及形成机制

circRNA根据来源可为3类：外显子circRNA、内含子circRNA和外显子-内含子circRNA。不过目前，circRNA的成熟机制尚不完全清楚。推测外显子circRNA是经历反向剪接而形成的[3]。目前有3种假说模型解释外显子circRNA的形成：第1种是套索驱动的环化，第2种是内含子配对驱动的环化，第3种是RNA结合蛋白(RBP)介导的环化[4]。

3 circRNA的特点

大多数circRNA是外显子circRNA。外显子circRNA主要存在于细胞质中，而少部分内含子circRNA和外显子-内含子circRNA则在细胞核中[4]。目前circRNA还被证实有以下特点：(1)多样性及丰富性：广泛存在于真核细胞中，种类繁多[5]；(2)稳定性：circRNA与线性RNA不同，是不带有5′帽子结构和3′末端ploy(A)尾巴的单链、共价闭环结构。该结构可能保护其不易被RNA外切酶(RNaseR)降解，从而比线性RNA具有更高的稳定性[6]；(3)保守性：circRNA在不同物种中高度保守[7]；(4)特异性：主要表现在细胞类型特异性及组织特异性[8]。

4 circRNA的功能

其主要功能是除了充当内源性竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)，或与miRNA结合，在细胞中起到分子海绵的作用外，还有与RBP相互作用等，近年还发现部分circRNA可以编码蛋白。随着大量的研究发现，circRNA在心血管疾病、阿尔兹海默症、癌症等各种疾病的发生发展中起着重要的作用。

4.1 充当ceRNA或miRNA海绵

circRNA作为ceRNA，竞争miRNA结合位点，从而减少miRNA与其靶位点的结合，从而减弱其靶向mRNA的能力。抑制miRNA的这种功能也被称为miRNA海绵[9]。目前研究circRNA的作用机制主要集中在此功能。大量circRNA也被证实通过此功能在癌症中发挥作用。例如：circANKS1B能够吸附miR-148A-3p和miR-152-3p，充当miRNA海绵发挥促进乳腺癌的侵袭、转移的作用[10]。circTP63竞争性地与miR-873-3p结合，作为ceRNA，取消了miR-873-3p对靶基因FOXM1的抑制作用，而升高的FOXM1可促进CENPA和CENPB的表达，进而推动细胞周期进展和细胞增殖[11]。

4.2 与RBP结合

某些circRNA可以作为蛋白质诱饵或者拮抗剂，并通过作为竞争元件来阻断蛋白质的活性[8]。例如：circAmotl1与Stat3在Dnmt3a启动子区有共同位点并相互作用，导致了细胞黏附、迁移、增殖、存活和伤口修复的增加。不仅如此，circAmotl1还与E2F1、E2F4、EGF、ETS-1、AP1、NF1之间也存在着相互作用[12]。

4.3 翻译蛋白

因为circRNA缺少5′帽子结构、3′末端poly(A)尾巴,所以一直被认为是无翻译功能。近年发现，一些circRNA是可以编码蛋白的。例如：CircPPP1R12A编码一个功能性蛋白，ZHENG等[13]称之为CircPPP1R12A-73aa，而体内外实验发现可以增强结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的是CircPPP1R12A-73aa而不是circPPP1R12A。最后，证实了circPPP1R12A-73aa是通过激活Hippo-Yap信号通路促进了结肠癌细胞的生长和转移。circSHPRH编码SHPRH-146aa，SHPRH-146aa可以避免SHPRH被泛素蛋白酶体降解。E3的连接酶SHPRH，可以泛素化增殖细胞核抗原(PCNA)，从而抑制细胞恶性增殖行为和降低致瘤性[14]。

5 circRNA与胃癌

胃癌是常见的胃肠道恶性肿瘤之一，同时位居全世界死亡原因第3名。虽然近年来手术和化学治疗效果显著提升，但是由于肿瘤转移和复发的原因，胃癌患者的5年总生存率依然低于30%[15]，故需要寻求特异性显著及敏感性强的早期诊断生物标志物和新的治疗手段。研究发现，胃癌中有许多表达异常的circRNA，并调控着胃癌的发生发展,加之circRNA的稳定性和组织特异性，均表明了circRNA今后有可能成为一种新的生物标记物用于诊断，也可能成为新的治疗靶点。

5.1 促进胃癌发生发展的circRNA

有一部分circRNA在胃癌中呈现高表达水平，起着促进胃癌发生发展的作用。WANG等[16]检测到位于细胞质中的circOSBPL10在胃癌组织中高表达，并且可以作为胃癌患者总生存期和无病生存期的一个预后指标。CircOSBPL10作为miR-136-5P的海绵促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。ZHU等[17]发现circNHSL1主要存在于细胞质中，而且在胃癌组织和细胞中高表达，与临床病理参数进行相关性分析，发现其表达水平与病理T分期、淋巴结转移、远处转移呈正相关,同时发现circNHSL1的表达水平与miR1306-3p的表达水平呈负相关，而miR-1306-3p的表达水平又与SIX1的表达水平呈负相关。进一步研究证实circNHSL1充当miR-1306-3p海绵，缓解了miR-1306-3p对SIX1的抑制作用，然后SIX1直接与Vimentin的启动子区域结合，在转录水平上增强了Vimentin的表达，施展增强胃癌细胞迁移和侵袭的能力，促进胃癌的进展。据报道，细胞周期或凋亡异常可以导致肿瘤的异常增殖。比如：与癌旁组织比较，circPDSS1在胃癌组织中的水平升高。采用流式细胞仪分析,circPDSS1表达敲除后，使胃癌细胞较多分布在G0/G1期，促进细胞凋亡。circPDSS1过表达，则结果相反[18]。

5.2 抑制胃癌发生发展的circRNA

在胃癌中还同样存在着可以抑制胃癌发生发展的circRNA。circ ZFR成为miR-107和miR-130a的海绵调节PTEN可以阻滞细胞周期，促使细胞凋亡，然后抑制胃癌细胞增殖[19]。circRNA_100269之前就被发现是一种预测肿瘤复发的生物标志物，但其在胃癌中的表达水平和功能尚不清楚。ZHANG等[20]采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测到circRNA_100269在胃癌组织和细胞中表达下降，后续试验证明了其靶向miR-630抑制肿瘤细胞生长。DAI等[21]从众多circRNA中筛选出circGRAMD1B，检测了其在胃癌组织和细胞中的表达水平，发现circGRAMD1B处于低表达的状态。后来通过一系列实验证实了circGRAMD1B作为抑癌基因，扮演miR-130a-3p的竞争性内源RNA的角色来抑制胃癌细胞的生长，减弱胃癌细胞迁移、侵袭能力。

circRNA在胃癌中的差异性表达，可以预示着胃癌的发展，今后很有可能成为一种早期诊断和预后评估的新的生物标志物。然而，关于胃癌患者血浆中circRNA的研究很少。JIANG等[22]回顾了多个circRNA研究，通过meta分析显示，这些circRNA的敏感性、特异性和AUC值均在70%以上，确定了circRNA对胃癌有很高的诊断价值。hsa_circ_0021087和hsa_circ_0005051也首次被证实在胃癌组织、细胞和血浆中的表达明显下调，提示它们可作为一种新的无创性生物标志物应用于胃癌的诊断。而且，hsa_circ_0021087在胃癌患者术前、术后血浆的表达差异有统计学意义(P<0.05)。更加有力地验证了血液中特异的circRNA可用于早期胃癌的诊断和术后评估[23]。

5.3 激活信号通路的胃癌相关circRNA

有时circRNA不只是调节靶基因，还可以激活一些癌症相关通路发挥作用。例如：Wnt/β-catenin是一条经典的、与细胞增殖相关的信号通路。LIU等[24]将胃癌组织和细胞中的circHIPK3表达水平与其在癌旁组织和正常胃黏膜上皮细胞中的表达水平进行比较，发现circHIPK3在胃癌组织和细胞中高表达。根据收集的随访数据进行生存分析发现circHIPK3的表达水平和胃癌患者的总生存期呈负相关。沉默circHIPK3不仅可以减弱细胞的增殖和迁移能力，还能下调WNT1、TCF4和β-catenin的表达水平。circHIPK3最终被证明是通过调控Wnt/β-catenin通路促进胃癌细胞的增殖和迁移。circMRPS35在胃癌组织中的表达明显降低。circMRPS35表达水平与临床病理参数TNM分期、淋巴转移及肿瘤大小有关，与FOXO1/3a的表达呈正相关。研究证明circMRPS35作为一个支架，将组蛋白乙酰转移酶KAT7募集到FOXO1和FOXO3a基因的启动子上,然后circMRPS35直接与FOXO1/FOXO3a启动子区域特异性结合，在体内外发挥抑制胃癌细胞增殖和侵袭的能力。GO富集和KEGG通路分析也表明，FOXO信号通路是其相关性最强的通路。总之circMRPS35是通过调控组蛋白修饰触发了FOXO通路来抑制胃癌的进展[25]。

5.4 影响上皮间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的circRNA

EMT是指上皮细胞失去黏附等特性，变成具有运动性、迁移性和侵袭性的间充质干细胞。在EMT进展过程中E-cadherin等上皮标志物表达减少，而N-cadherin、Vimentin和claudin等间充质标志物表达增加。还有多种EMT转录因子(EMT-TF)，包括Snail、Twist和Zeb家族，汇聚成EMT调控因子。目前已经有研究发现EMT参与肿瘤转移过程[26]。ZHANG等[27]发现circCACTIN在胃癌组织和胃癌细胞中的表达水平明显增高。敲除circCACTIN后可抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和下调Vimentin和Snail1的表达，上调E-cadherin的表达。过表达则呈现相反的情况，但对胃癌细胞的增殖无影响。他们同时还证明了circCACTIN通过竞争ceRNA的机制影响胃癌的进展。circHIAT1过表达可以显著降低细胞存活率，促使胃癌细胞凋亡，还能使E-cadherin水平明显升高，而N-cadherin，Vimentin和Zeb1水平显著降低，由此可见circHIAT1还可以抑制EMT的发生。深入研究发现circHIAT1除了通过阻碍细胞生长、抑制EMT过程，还抑制PTEN/PI3K/AKT和ERK信号通路发挥抗肿瘤作用[28]。另外，还有circ_0000267也可以促进胃癌细胞的增殖、转移和EMT过程[29]。胃癌中不同的circRNA的表达及临床价值见表1。

表1 胃癌中不同的circRNA的表达及临床价值

6 小 结

circRNA从一开始被认为无生物学功能，到今天成为疾病领域研究热点，尤其是在癌症中存在着重大作用并得到科学家的认可。尽管如此，由于circRNA与线性RNA的序列几乎完全重叠，使得对circRNA的表达和功能的准确评估仍然具有挑战性。例如：外显子circRNA是通过反向剪接形成，那剪接体是如何特异性地识别circRNA的外显子，而不是线性RNA的这些外显子。最近的研究发现m6A修饰的circRNA通常来自mRNAs中没有甲基化的外显子，而甲基化的mRNA外显子的circRNA稳定性较差，至于 m6A修饰是否会影响circRNA的稳定性仍不清楚。circRNA又是如何降解的，以及环状结构可能赋予与它们对应的线性RNA哪些不同的功能。circRNA的功能含义只被初步探索，可能是由于研究工具的限制[30]。已有越来越多的研究证明了circRNA与胃癌的发生发展密切相关，预示着circRNA未来极有可能呈为胃癌新的治疗靶点和生物标志物。circRNA表达水平与临床病理参数分析，发现其表达水平可与性别、肿瘤大小、浸润深度、TNM分期、癌胚抗原等相关。但这些结果仍然需要在更多的病例中得到证实。目前的研究标本主要是肿瘤组织，考虑到采集肿瘤组织操作不便，加之circRNA可存在于唾液、血液等体液中。所以今后可着重检测体液中circRNA的水平并分析它的敏感度及特异性，研究circRNA更重要的目的是为了早诊断，早治疗。目前针对胃癌的治疗主要包含手术治疗、化疗和放疗。手术治疗对于早期胃癌的效果较好。而对于晚期胃癌患者来说则建议选择新辅助治疗，或者单一的放化疗。部分患者对化疗或者放疗不敏感或者耐受性较差，而且抗癌药物开发周期较长，如何提高药物及射线的敏感性也是需要探究的难题。胃癌最让人困扰的问题就是复发。很多患者因为工作、生活、还有胃镜检查繁琐耗时等原因，总是忽略胃镜检查。所以寻求检测胃癌复发的新方式也是胃癌治疗的重中之重。目前已经有一些circRNA被研究者发现可以用于预测胃癌复发，且改善耐药。但是circRNA的各种研究最终的目的是应用于临床工作中，所以仍需要大量的试验、时间来证明。同时也要做好对大众普及胃癌方面的知识，提高体检的意识等工作。毕竟胃癌形成的过程复杂，研究者们也面临着多方面的挑战，需要更多时间、精力去攻克。

7 展 望

circRNA的发现为胃癌研究者、临床医生和胃癌患者带来了希望，为目前治疗方式的“瓶颈期”开拓新的视角，提供了新的思路。尽管现在对circRNA的认识还不够全面，相信随着新技术的应用和科学家的不断努力，circRNA的神奇奥秘终将会被解开。总之，circRNA潜力无穷，未来可期。