外周血CK-19、Vimentin mRNA在早期诊断乳腺癌复发、转移中的应用研究

王合兵，肖坚，陈文新，杨炳林，卓德祥

（福建医科大学附属三明第一医院 1.乳腺科 2.检验科，福建 三明 365000）

乳腺癌是乳腺组织上皮细胞发生癌变的一种恶性肿瘤，其在妇女群体中尤为高发，尤其是40～55 岁中老年妇女，占妇女肿瘤约1/3［1］。据报道，乳腺癌的发病机制尚不清晰，然而诱导其高发的危险因素广泛存在，包括遗传、生活习惯等［2］。乳腺癌在临床早期症状不明显，且患者意识较弱，其多表现为乳头凹陷、乳头溢液等［3］。有研究指出，乳腺癌本身无致命危险，但具有全身性，从早期阶段开始肿瘤细胞便可通过血液或者淋巴管进行微小转移，多数患者手术治疗后体内仍存在未检测出残余的肿瘤小病灶，在短暂时间内便可复发。因此，疾病的转移和复发是导致其危险性高的关键［4］。

近年来乳腺癌更加高发，跃居肺癌之后，对妇女患者打击巨大，加上人们生活质量的提高，该疾病的及时治疗受到关注［5］。降低疾病转移率和复发率的关键在于早期检测出患者体内转移微病灶并于治疗后监控残存的微病灶。以往临床会根据乳腺癌分期、淋巴结转移数等指导治疗方案，但其均建立在患者有意识地就医基础上，因此常规方法过于局限且准确性偏低［6］。现有研究指出，通过检测外周血中波形蛋白（Vimentin）、细胞角蛋白19（CK-19）水平来诊断乳腺癌准确性更高，尤其用于早期诊断及预后［7］。本文对外周血CK-19、Vimentin 信使RNA（mRNA）在早期诊断乳腺癌复发、转移中的应用进行研究，旨在为临床提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014 年8 月至2016 年7 月福建医科大学附属三明第一医院收治的68 例乳腺癌女性患者，根据阳性率高低分为观察组（阳性率高）和对照组（阳性率低），每组34 例。其中，年龄22～73 岁，平均（46.53±16.25）岁。纳入标准［8］：①符合乳腺癌的诊断标准［9］；②经X 射线或乳腺彩超诊断；③经组织病理学证明；④无其他恶性肿瘤引起的转移病灶或恶性肿瘤；⑤患者及其家属签署知情同意书。排除标准：①并发血液性、免疫性疾病；②并发严重的基础功能性疾病；③伴有严重抑郁等精神类疾病。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

所有研究对象入院后行外周血CK-19、Vimentin mRNA 检测，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测CK-19、Vimentin。按说明书应用Trizol 试剂盒（美国Invitrogen 公司）提取样本总RNA,DNA Marker、逆转录试剂盒、琼脂糖、扩增试剂盒均购于大连宝生物工程公司，所用的引物均由大连宝生物公司设计并合成。将样本加入1 mL Trizol 裂解，200 μL 氯仿萃取，75% 乙醇洗涤，然后开始逆转录反应，每管逆转录反应体系总量10 μL。每管中加入各种试剂固定总量为5.25 μL，再加入1 μg 总RNA 体积，用DEPC-H2O 补充至10 μL，混匀、离心。反应条件：42℃预变性30 min，99℃变性5 min，4℃退火5 min，72℃延伸8 min延伸以灭活逆转录酶。生成cDNA 进行PCR 扩增。反应条件：95℃预变性15 min，95℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共20 个循环。

1.3 观察指标

①比较两组转移复发率；②计算血清CK-19、Vimentin mRNA 单项检测及两种指标联合检测诊断乳腺癌的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性；③用Logistic 回归分析血清CK-19、Vimentin mRNA 诊断乳腺癌的临床价值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；多因素分析用Logistic 回归模型，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组转移复发率比较

观察组与对照组发生复发转移分别为23 例（67.65%）、8 例（23.53%），两组转移复发率比较，差异有统计学意义（χ2=13.339,P=0.000）。

2.2 各标志物及联合检测的诊断效果指标情况

CK-19+Vimentin 联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及准确性高于各指标单独检测，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各标志物及联合检测的诊断效果指标情况（%）

2.3 各指标对乳腺癌诊断价值的Logistic 回归分析

Logistic 回归分析显示，CK-19、Vimentin mRNA 及CK-19+Vimentin 与乳腺癌诊断有密切的相关性（P<0.05）。见表2。

表2 各指标对乳腺癌诊断价值的Logistic 回归分析参数

3 讨论

目前，乳腺癌已成为广受注目的高危性疾病之一，其危险性主要体现为转移和复发。随着人们生活压力的增大，吸烟、饮酒等高危因素越来越多，导致乳腺癌发病率不断增加，因此对乳腺癌的治疗已成为临床关注的焦点［10］。有研究指出，在疾病早期，肿瘤细胞便开始从原发灶脱落，经血液循环存在于外周血、淋巴结中，其在合适的机会下侵入其他组织，导致疾病的转移或复发；从肿瘤原发灶或转移灶脱落进入血液循环形成的恶性细胞称循环肿瘤细胞（CTCs），其容易引起肿瘤的进展和远处转移［11］。因此，乳腺癌的早期诊断和术后监测至关重要。有报道显示，仅凭以往采用的影像技术对患者手术前后进行检查，检查出微转移灶的可能性较低，导致误诊率和复发率较高，且其成本较高［12］。现阶段随着肿瘤治疗技术的不断发展，临床逐渐意识到CTCs 作为检验指标所起的关键作用，其可在RT-PCR 技术的作用下进行扩增，达到具有敏感性和特异性的诊断价值，而CK-19 mRNA 和Vimentin mRNA 是CTCs 表达的主要因子，其用于诊断乳腺癌早期的可靠标志物对科技、经济及社会的发展具有很好的推动作用［13］。

以往大量研究表明，临床研究的CTCs 多以间质亚型存在，其具有存活于血液循环并适时入侵其他组织器官的能力［14］。CK-19 mRNA 作为乳腺癌CTCs 的上皮型标志物，CK 是一种骨架蛋白，其构成了上皮细胞的骨架以保持其完整和连续；同时其也构成了来源于上皮细胞的肿瘤细胞的中间丝，决定着上皮细胞的增值分化程度。正常情况下，其在外周血中不存在CK-19 mRNA；而在病理情况下，当机体乳腺组织的上皮肿瘤细胞侵入血液，血液中便可检测到CK-19 mRNA，因此其可作为检测乳腺癌早期、转移或复发的指标。然而有研究指出，在转移性的上皮型肿瘤中，在较多样本中并不能检测到CK-19 mRNA，可能是由于在以上皮型抗原为目的的实验过程中，另一种细胞亚群被忽视，即Vimentin［15］。多项研究证实，血清Vimentin mRNA 是诊断乳腺癌的特异性标志物，其在疾病转移、复发的监测中价值较高［16］。上皮-间充质转化过程（EMT）是指病理情况下上皮细胞转化为间充质细胞的过程，与癌症的进展与转移等进程密切相关。EMT 发生时，可导致乳腺癌上皮细胞丧失其原上皮表型如Cytokeratin、Ecadherin 等，转化为Vimentin、Fibronectin 等间质表型，细胞骨架也由以CK 为主转变为以Vimentin 为主。

有研究显示，正常人生理情况下，外周血检测不会出现Vimentin RNA，而原上皮表型的乳腺癌细胞转化为间质性侵入外周血中，Vimentin RNA 便可在血液中检测出。因此，其可作为检测乳腺癌早期的灵敏指标，此外也可用作检测患者术后残留小病发灶的指标［17］。但有研究发现，当机体出现其它上皮细胞的癌变并且癌细胞入血时，也能引起外周血Vimentin RNA 水平升高，其检测特异性受限［18］。因此可发现该两项指标单项检测时的敏感性和特异性均受限。大量研究证实，联合两项指标检测可综合两者的优点，避免局限性，最终提高临床诊断的准确性和诊断价值［19-20］。本研究结果显示，观察组发生复发转移数明显多于对照组，表明复发转移的患者外周血CK-19、Vimentin mRNA 的阳性率高，通过比较阳性率或敏感性等方面差异，较临床影像检测出复发转移时间更早，突出乳腺癌外周血CK-19、Vimentin mRNA 的阳性率在早期诊断复发转移乳腺癌中的应用价值；同时CK-19、Vimentin mRNA 联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性高于各指标单独检测，证实两项指标联合诊断的准确率更高，有利于乳腺癌的早期诊断及术后恢复监测，有利于患者预后提高。

综上所述，血清CK-19、Vimentin mRNA 对于乳腺癌的早期诊断和转移具有一定的价值，同时指标的联合检测可增加准确性，指导患者治疗效果明显，值得临床推广应用。