致病疫霉游动孢子制备方法研究

杨祝强，王洪洋，唐 唯，李灿辉，刘 晶

(1.云南师范大学 云南省马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500；2.云南师范大学 云南省高校马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500)

马铃薯作为全球第三大粮食作物，在人类粮食安全中发挥着重要作用[1-2]。然而，由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的马铃薯晚疫病，在世界范围内导致马铃薯产量降低，甚至引起马铃薯绝收，造成严重的经济损失[3-7]。1845年，马铃薯晚疫病在爱尔兰大暴发并造成饥荒，致使数百万人死亡[8]。当前，晚疫病仍是现代马铃薯生产上的巨大问题[9]。致病疫霉属于藻界(Chromista)卵菌门(Oomycota)鞭毛菌亚门(Mastigomycotina)卵菌纲(Ommycetes)霜霉目(Peronosporales)腐霉科(Pyhiaceae)疫霉属(Phytophthora)[10]。致病疫霉的生活史分为无性世代和有性世代，在无性世代中，孢子囊是致病疫霉无性阶段最主要的繁殖器官和侵染器官。与菌丝体相比，孢子囊抵抗不利环境的能力更强且更易于传播。当外界环境湿度较高、温度在24～25 ℃时，孢子囊直接萌发产生芽管[11]；当外界环境湿度较高、温度较低(最适温度10～15 ℃)时，孢子囊释放出游动孢子[3]。致病疫霉的游动孢子呈肾形，具2根鞭毛，能在水中游动；游动孢子侵染寄主植物前，其鞭毛脱落，形成球形的休止孢，之后休止孢萌发产生芽管侵入寄主体内[12]。游动孢子的主要作用是帮助病原菌扩散到合适的侵染部位进行侵染，并且游动孢子也是非常有效的繁殖体[13-14]。无论是孢子囊直接萌发还是孢子囊释放游动孢子均能够引起田间多次再侵染并造成病害大流行[15]。马铃薯种质资源抗晚疫病评价、抗晚疫病基因挖掘及克隆、致病疫霉致病机制等相关研究中都需要大量的游动孢子作为接种菌源及研究材料。因此，探索游动孢子的最佳释放条件至关重要。在辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)及大豆疫霉(Phytophthoranicotianae)等疫霉属致病卵菌中，游动孢子制备的最佳条件不尽相同，但游动孢子的产生均离不开水[16-21]。目前，尚未有致病疫霉游动孢子最佳制备条件的相关报道，鉴于此，探索致病疫霉孢子囊和游动孢子制备的最佳条件，为今后致病疫霉致病机制及马铃薯抗晚疫病研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 供试菌株为致病疫霉88069菌株, 由云南师范大学马铃薯科学研究院保存并提供。

1.1.2 供试培养基 供试培养基为黑麦-V8培养基，配制方法如下：向60 g浸泡过夜的黑麦中加入1 000 mL蒸馏水，121 ℃高压蒸汽灭菌40 min，经2层纱布过滤得到黑麦汁，向黑麦汁中加入V8蔬菜汁100 mL、琼脂20 g、碳酸钙1 g，调pH值至7.0，加ddH2O补足至1 000 mL，121 ℃高温高压灭菌20 min备用。

1.1.3 供试溶液 供试溶液为Petri’s溶液。50×Petri’s母液配制方法如下：CaCl21.39 g，MgSO46.02 g，KH2PO46.80 g，KCl 2.98 g，加ddH2O定容至1 000 mL，使用前稀释成1×Petri’s溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养 用接种针挑取保存的致病疫霉88069接种于黑麦-V8培养基上，18 ℃黑暗培养。

1.2.2 孢子囊的制备 将18 ℃黑暗培养9 d的88069菌株用直径为0.8 cm的打孔器在培养平板上随机均匀地打取菌丝块，并接种于新的含黑麦-V8培养基的平板上，每个平板均匀接种3块菌丝，18 ℃黑暗条件下分别培养7～12 d。向以上培养7～12 d的88069菌株中分别加入3 mL Petri’s溶液，用灭菌玻璃涂布棒将培养基上的孢子囊刮下，经Microcloth过滤后转移到预冷的离心管中，统计1 mL孢子囊悬浮液中的孢子囊个数，并将其稀释成104个/mL备用。

1.2.3 游动孢子的制备 分别采用5种不同低温诱导组合方法制备游动孢子。方法M1：将孢子囊悬浮液于10 ℃下静置30 min，再在18 ℃下静置30 min；方法M2：将孢子囊悬浮液于4 ℃下静置30 min，再在10 ℃下静置90 min；方法M3：将孢子囊悬浮液于4 ℃下静置30 min，再在10 ℃下静置60 min；方法M4：将孢子囊悬浮液于4 ℃下静置3 h；方法M5：将孢子囊悬浮液于4 ℃下静置2 h，再在18 ℃下静置1 h。

1.2.4 孢子囊及游动孢子的计数 用移液枪吸取5 μL孢子囊或游动孢子悬浮液，将悬浮液在载玻片上轻拉成一条细线，计算样本中的孢子囊或游动孢子总数，每个样本取样5次，计算1 mL悬浮液中的孢子囊或游动孢子个数。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism和SPSS 18.0软件进行作图和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 致病疫霉孢子囊和游动孢子的形态特征

致病疫霉孢子囊呈长柠檬形，顶端有乳突，另一端有小柄，小柄易从菌丝上脱落(图1)。当环境湿度较高且温度较低的条件下，孢子囊可从乳突释放出游动孢子(图2)。游动孢子呈肾形，从孢子囊中释放后便无规则游动，40×10倍镜下可隐约看到2根鞭毛(图2A、B)。游动孢子释放完毕后形成空孢子囊壳(图2C) 。

A、B、C分别为10×10、20×10、40×10倍镜下的孢子囊形态，黑色箭头所指为孢子囊A,B,C are the sporangia morphology under 10×10,20×10 and 40×10 magnifications respectively,the black arrow points to the sporangium图1 致病疫霉孢子囊的形态Fig.1 The morphology of P.infestans sporangium

A.孢子囊正在释放游动孢子(40×10)； B.游动孢子(40×10); C.游动孢子及空孢子囊(20×10),黑色箭头所指为游动孢子，白色箭头所指为空孢子囊A.Sporangium is releasing zoospores (40×10); B.Zoospore (40×10); C.Zoospores and empty sporangium(20×10),the black arrow indicates zoospores while the white arrow indicates empty sporangium图2 致病疫霉游动孢子的形态Fig.2 Morphology of zoospores of P.infestans

2.2 不同培养时间对致病疫霉孢子囊产量的影响

为测定不同培养天数对致病疫霉孢子囊产量的影响，将致病疫霉接种于黑麦-V8培养基上，在18 ℃黑暗条件下分别培养7～12 d并收集孢子囊。结果显示，孢子囊产量先迅速增加，随后增速放缓，直至基本不再增加(图3)。培养7 d的致病疫霉孢子囊产量最低，为4.87×104个/mL，之后孢子囊产量迅速增加。第8、9天孢子囊产量分别比前1 d增加71.3%、79.2%。从第10 天开始，孢子囊产量增速稍有降低，相比第9天孢子囊产量增加了66.07%。第11天的孢子囊产量增速大幅下降，仅比第10天孢子囊产量增加了23.7%，孢子囊产量为3.07×105个/mL。随后孢子囊产量进入平台期，第12天的孢子囊产量与前1 d相比无显著差异，为3.15×105个/mL (图3)。

2.3 不同培养时间及制备方法对致病疫霉游动孢子产量的影响

为测定不同培养时间及制备方法对致病疫霉游动孢子产量的影响，分别在黑麦-V8培养基上培养致病疫霉7～12 d收获孢子囊，并用5种方法分别制备游动孢子。结果表明，用培养7～9 d的致病疫霉收获的孢子囊制备游动孢子时，无论选择哪种制备方法，游动孢子产量起初均随着培养时间的延长而增加，并在第9天达到峰值；之后，当培养时间延长到10～12 d时，游动孢子产量均显著下降，尤其是方法M1，用培养12 d收获的孢子囊制备游动孢子时，游动孢子产量较培养9 d的减少77.71%(图4)。使用培养9 d得到的孢子囊制备游动孢子时，游动孢子产量最高，且5种不同方法得到的游动孢子产量差异不显著。除使用培养9 d收获的孢子囊制备的游动孢子产量最高外，其他培养时间下得到的游动孢子量根据制备方法的不同稍有差异。结合图3及图4的结果可知，孢子囊产量大时其游动孢子产量并不一定大，二者之间不完全呈正相关。因此，要快速得到大量的游动孢子，可以收集培养9 d的致病疫霉孢子囊，将其在10 ℃下静置30 min，再在18 ℃下静置30 min(M1)，收集游动孢子。如果不考虑制备时间，可以用培养9 d的致病疫霉孢子囊在4 ℃静置2 h后再在18 ℃静置1 h，即可获得最大量的游动孢子。

不同小写字母表示差异显著(Tukey’s HSD,P<0.05)Different lowercase letters mean significantdifference among groups(Tukey’s HSD,P<0.05)图3 不同培养时间致病疫霉的孢子囊产量Fig.3 The sporangia yield of P.infestans under different culture time

不同小写字母表示同一时间不同方法差异显著Different lowercase letters mean significant difference among different methods at the same time图4 不同培养时间、不同制备方法对致病疫霉游动孢子产量的影响Fig.4 Effect of different culture time and different preparation methods on zoospore yield of P.infestans

3 结论与讨论

由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产上的主要病害之一，该病害严重威胁马铃薯的生产和全球粮食安全[2-3]。致病疫霉释放的游动孢子是侵染马铃薯并引起晚疫病的主要田间因素之一。因此，优化致病疫霉游动孢子的制备条件对筛选马铃薯抗晚疫病品种、挖掘其抗晚疫病基因以及解析致病疫霉的致病机制等具有重要意义。本研究探讨了不同培养时间对致病疫霉孢子囊产量的影响，以及不同培养时间、不同制备方法对致病疫霉游动孢子产量的影响。结果表明，用培养9 d 的致病疫霉收获的孢子囊能够制备得到大量游动孢子，且不同制备方法得到的游动孢子产量差异不显著。如要快速大量制备游动孢子，可收集培养9 d的致病疫霉孢子囊，将其在10 ℃下静置30 min，再在18 ℃下静置30 min。如要得到最大量的游动孢子且不考虑制备时间，可收集培养9 d的致病疫霉孢子囊，将其在4 ℃静置2 h后再在18 ℃静置1 h。

在疫霉属其他植物致病菌中也有关于游动孢子最佳制备条件的报道，其中有关辣椒疫霉孢子囊及游动孢子的制备条件等研究报道相对较多，研究结果也不尽相同。张荣等[16]研究发现，辣椒疫霉游动孢子的最佳诱导条件是，该菌在玉米粉琼脂培养基上26 ℃暗培养3 d并持续光照培养6 d，再加无菌水并置于16 ℃光照0.5 h。李立凤等[17]研究表明，将长满菌丝的辣椒疫霉培养皿加入30 mL灭菌水后于30 ℃全光照处理6 d时，游动孢子产量最大。许亚池等[18]对辣椒疫霉游动孢子的最佳产生方法进行探究，结果发现，辣椒疫霉在5% V8培养基上28 ℃黑暗培养5 d，向培养皿内加入无菌水后再在28 ℃下全光照培养5 d，可诱导该菌产生大量的游动孢子。此外，在烟草疫霉及大豆疫霉(Phytophthorasojae)中也有游动孢子制备方法的相关报道。杨建卿等[19]经过试验研究得出，在滴加了土壤浸出液的皮氏培养液中，烟草疫霉菌丝可在3 d内产生大量的游动孢子囊，游动孢子囊经低温处理后再培养24 h可产生大量游动孢子。AHONSI等[20]研究发现，温度显著影响烟草疫霉游动孢子的产生；22 ℃下游动孢子产量最高，36 ℃下游动孢子的形成被完全抑制。赵艳龙等[21]比较了不同培养方法对烟草疫霉游动孢子产生的影响，结果表明，菌丝块-水培法产生游动孢子的速度最快、数量最多，且方法简单，是最佳的培养方法。左豫虎等[22]研究发现，间歇性地给大豆疫霉菌丝块换水可以诱导菌丝产生孢子囊，进而释放游动孢子。兰成忠等[23]对诱发大豆疫霉产生游动孢子囊的10种方法进行了比较，结果发现，土壤浸出液法和皮氏液加土壤浸出液法能够得到大量的游动孢子。综合前人研究结果可以看出，疫霉属卵菌的游动孢子释放条件各不相同，但游动孢子的产生都离不开水。

本研究以致病疫霉为材料，探讨了不同培养时间及不同低温诱导组合的方法对其游动孢子释放的影响。致病疫霉孢子囊的产量起初随着菌株培养时间的延长而快速增加，随后孢子囊产量增速放缓，当培养时间继续延长时，孢子囊产量基本不再增加，培养12 d得到的孢子囊产量与前1 d相比差异不显著。收集不同培养时间收获的孢子囊并制备游动孢子，游动孢子的产量随着孢子囊培养日龄的增加均呈现先升高后降低的趋势。当培养时间为9 d时，游动孢子产量最高且不同制备方法得到的游动孢子产量差异不显著；当培养时间大于9 d时，不同制备方法得到的游动孢子产量均迅速下降。该研究结果表明，孢子囊产量与游动孢子产量并不完全呈正相关，这与张荣等[16]、王晓敏等[24]关于辣椒疫霉游动孢子诱导条件的研究结论一致。推测当培养时间大于9 d时游动孢子产量下降的原因可能是由于后期孢子囊随着培养时间的延长逐渐成熟并衰老，从而影响到游动孢子的释放。该研究结果为大量制备致病疫霉游动孢子提供了参考，为后续马铃薯抗晚疫病研究及致病疫霉的致病机制等相关研究奠定了基础。