以4-叔丁基环己醇为内标物定量分析茶叶的香气成分

汪 鹏, 王 璐, 陈杰博, 郑莛予, 褚杜娟, 胡文文, 叶江华, 何海斌

[1.福建省农业生态过程与安全监控重点实验室(福建农林大学)，福建 福州 350002;2.国家甘蔗工程技术研究中心，福建 福州 350002;3.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002;4.武夷学院茶与食品学院，福建 武夷山 354300]

茶叶在公元前2700年就已经开始被人类饮用，作为世界上的三大饮料之一，深受世界人民的喜爱[1].根据《茶叶感官审评方法》[2]，乌龙茶品质评价总分为100分，为外形15分、汤色10分、香气35分、滋味30分、叶底10分，可见，茶叶香气是反映茶叶品质的主要感官特性之一[3].随着仪器分析方法与技术的开发与普及，通过分析仪器，如气相色谱—质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)仪来定量分析茶叶的香气成分，从而对茶叶品质进行评价成为了一种常见的研究方法[4].近年来，顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)已被证明是一种简便、可靠的茶叶香气分析技术，该技术是一种无溶剂的方法，用于分离和浓缩存在于顶空瓶中的挥发性化合物，不会因温度或溶剂效应而使挥发性化合物变质，并且可以减少低沸点挥发物的损失[5-7].HS-SPME/GC-MS技术已广泛应用于普洱茶[7]、乌龙茶[8]和汉中红茶[9]香气成分的检测.

在GC-MS测定样品挥发物中，普遍采用的是归一化法对不同组分的色谱峰面积进行定量分析.该方法操作简便，可以快速比较谱图中不同组分相对含量的高低，受到研究人员的广泛接受.但在不同茶产品比较分析中，归一化法存在致命的缺陷，这源于归一化法是用目标峰面积与总峰面积之比来定量，而不同茶叶样品中检测到的组分数目和总峰面积差异较大，相对百分比不能准确体现不同样品中挥发物的真实含量.为此，采用内标法对目标组分进行定量就成为主要方法，如研究人员[8,10-11]采用正构烷烃为内标物结合SPME/GC-MS对茶叶香气成分进行定量分析.然而，C8～C20正构烷烃色谱峰容易掩盖丰富的茶叶挥发性组分，导致定量结果出现偏差.Lü et al[7]和Feng et al[12]曾尝试用癸酸乙酯作为内标物，但该方法的重复性和稳定性较差，并且癸酸乙酯溶解在乙醇溶剂中，溶剂的挥发性强，掩盖茶叶中的香气组分，导致定量结果出现偏差.Wang et al[13]直接将内标物(0.03%庚酸乙酯)添加入茶叶中，但茶叶颗粒也能吸收内标物，使色谱峰面积出现偏差，定量结果出现误差.内标物的选择在茶叶香气成分定量分析中起着标尺作用，因此，内标物本身应具有一定的挥发性.茶叶中挥发性成分含量低，内标物的使用量应尽可能少，需要将内标物溶于溶剂中，该溶剂应具有低挥发性；此外，还应避免内标物以及溶剂色谱峰与茶叶挥发性成分色谱峰的重叠.

4-叔丁基环己醇具有一定的挥发性，溶剂为水，其溶解度小于1 g·L-1.相比于茶叶中含量较低的挥发性成分，低溶解度的内标物可以更好地进行定量分析.此外，相比于癸酸乙酯等其他溶于有机溶剂的内标物，该内标物采用水作为溶剂，色谱图中无溶剂峰，出峰时间位于整个色谱图的后期，色谱峰不会过高以及峰宽过大从而掩盖其他香气成分的色谱峰，影响香气成分的定性和定量.试验过程中将内标物添加至顶空瓶壁上，未与茶叶进行直接接触，避免了内标物被茶叶吸附而产生误差.4-叔丁基环己醇的这些特点满足了作为内标物的基本要求.为了进一步考察4-叔丁基环己醇作为内标物在评价香气成分及含量的可行性，本试验对该物质进行了方法学考察，并用武夷岩茶‘肉桂’为样品进行香味物质定量分析.

1 材料与方法

1.1 材料

4-叔丁基环己醇、2-戊基呋喃、对伞花烃、糠醛、芳樟醇、水杨酸甲酯和戊酸均为分析纯，购自上海阿拉丁化学试剂有限公司.

将候选的内标物4-叔丁基环己醇溶解在超纯水中，制备含量为200 mg·L-1的内标物储备液并保存在冰箱(4 ℃)中.以2018年生产的武夷岩茶‘肉桂’为样品(由武夷山和祥茶业有限公司提供)并保存在冰箱(4 ℃)中.

1.2 内标物的检测

在茶叶样品中添加内标物，以未添加内标物的谱图为对照，考察内标物的出峰时间、峰面积和重复性等结果.

在测定香气成分之前，将茶叶样品从冰箱中取出并在室温下放置1 h[14].样品均使用研钵研磨，收集通过60目(0.250 mm)筛网的粉末，用于下列试验.

将2 g粉末样品置于20 mL顶空瓶中，密封，置于50 ℃加热器中，加热平衡30 min，使茶叶的香气成分充分挥发，接着将SPME纤维萃取针(50 mm，DVB/CAR/PDMS，购自美国宾夕法尼亚州色谱科公司)插入顶空瓶中吸附挥发性化合物30 min，之后将萃取针立即插入GC-MS进样口并停留5 min，为未加内标物的空白对照.将2 g粉末样品置于20 mL顶空瓶中，在顶空瓶中的衬管内加入5 μL 30 mg·L-1内标物储备溶液，密封，按同样方法吸附萃取进样，为添加内标物的试验样.重复6次做重复率试验.

GC-MS条件：参照Kumazawa et al[15]的方法并进行了修改.GC-MS联用仪为7890A-5975C(美国加利福尼亚州安捷伦公司)，色谱柱选用DB-WAX柱(60 m×0.32 mm×0.25 mm)；升温程序如下：35 ℃保持5 min，以3 ℃·min-1的速度升温到150 ℃，然后以10 ℃·min-1的速度升温至240 ℃，保持2 min；载气为氦气(纯度>99.999%)；恒定流速1 mL·min-1；无分流进样.

质谱条件：EI电离模式；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；发射电流34.6 μA；进样口温度280 ℃；质量扫描范围为50～500 amu；溶剂延迟3 min.

检索谱库为NIST8.0；数据处理软件为Microsoft Excel 2013.

1.3 考察目标的定量分析

为了评价内标物4-叔丁基环己醇对香味物质的定量效果，选择前人报道中茶叶的6个主要香气成分，即2-戊基呋喃、对伞花烃、糠醛、芳樟醇、水杨酸甲酯和戊酸[7,16-18]为考察目标，考察内标物对其定量结果的准确性.该6个物质在‘肉桂’空白对照色谱图中的信息如表1所示(表1中的信息来自附件表Ⅰ，扫OSID码可见).

表1 6个考察目标的谱图信息1)Table 1 Chromatogram information of the 6 investigation targets

制备了4-叔丁基环己醇水溶液(10.00、30.00、50.00、150.00、200.00 mg·L-1)以及2-戊基呋喃(10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 mg·L-1)、对伞花烃(1.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mg·L-1)、糠醛(10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 mg·L-1)、芳樟醇(5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mg·L-1)、水杨酸甲酯(5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 mg·L-1)、戊酸(1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg·L-1)6种标准品的乙醇水溶液，用GC-MS仪测定(仪器条件与“1.2”相同)，制作各物质的标准曲线，计算考察目标与内标物的相对重量校正系数.

将下列6种考察目标添加到茶叶样品中，进行回收率试验.制备60.00 mg·L-12-戊基呋喃、1.00 mg·L-1对伞花烃、10.00 mg·L-1糠醛、10.00 mg·L-1芳樟醇、10.00 mg·L-1水杨酸甲酯和1.00 mg·L-1戊酸溶液，将1 μL 2-戊基呋喃、1 μL对伞花烃、1 μL糠醛、2.4 μL芳樟醇、1 μL水杨酸甲酯和1 μL戊酸分别加入2 g茶叶样品中，参照内标物精密度试验方法[19]，用GC-MS仪测定各物质含量(仪器条件与“1.2”相同)，重复3次，计算回收率.6种考察目标在茶叶中的含量参照表1中的峰面积进行计算.

1.4 数据分析

所有试验均包含3次重复，结果以平均值±标准偏差表示，差异显著性检验采用JMP 10.0软件(美国北卡罗来纳州SAS研究所)完成.

2 结果与分析

2.1 ‘肉桂’的色谱图与内标物可行性分析

‘肉桂’的色谱图如图1所示(谱图物质见附件表Ⅰ和表Ⅱ，扫OSID码可见).未加内标物的‘肉桂’共有56个峰，峰面积4 142.46×106.其中，匹配度>50%的物质有42个，峰面积3 444.24×106，占比83.14%(表2).添加内标物4-叔丁基环己醇的‘肉桂’共有63个峰，峰面积4 566.77×106.其中，匹配度>50%的物质有49个，峰面积3 616.55×106，占比79.19%.内标物4-叔丁基环己醇的保留时间为42.291 min，峰面积(122.43±24.19)×106，占比(2.67±0.39)%.4-叔丁基环己醇的前一个物质为芳樟醇氧化物(吡喃型)，保留时间为42.120 min，后一个物质为α-法尼烯，保留时间为42.426 min.可见添加4-叔丁基环己醇后，整个谱图峰面积增加较少，也不影响其前后物质的正常出峰.

(a)、(b)、(1)分别为‘肉桂’(无内标物)、‘肉桂’(含内标物)、内标物4-叔丁基环己醇的色谱峰.图1 ‘肉桂’的色谱图Fig.1 Chromatogram of ‘Rougui’ tea

表2 不同处理的‘肉桂’样品谱图数据Table 2 Chromatogram data of ‘Rougui’ under different treatments

6次重复性试验结果(表3)表明，内标物4-叔丁基环己醇的平均值为1.15×108，标准偏差为±0.11×108，相对标准偏差为9.78%(小于10%)，说明该方法稳定性较好.4-叔丁基环己醇作为内标物具有良好的重复性.

表3 内标物4-叔丁基环己醇的重复率Table 3 Repeatability of internal standard 4-tert-butylcyclohexanol

2.2 考察目标的定量分析

从内标物和6个考察目标的标准曲线(图2)可以看出，7个物质的标准曲线线性较好，相关系数R2为0.999～1.000.相对质量校正因子计算含量的相对标准偏差均小于10%(表4)，说明该方法稳定性较好.6个考察目标的回收率为80.00%～120.00%(表5)，符合分析要求.

图2 内标物和6个考察目标的标准曲线Fig.2 Standard curves of the internal standard and 6 investigation targets

表4 考察目标的质量校正因子Table 4 Quality correction factors of investigation targets

表5 考察目标的回收率1)Table 5 Recovery rates of the investigation targets

2.3 不同定量方法挥发性物质比较分析

采用归一化法和内标法对‘肉桂’中匹配率>50%的物质进行归类分析.结果(表6)表明：茶叶香味潜在物质主要为10个醇类(峰面积比15.54%，含量442.562 0 ng·g-1)、9个醛酮类(峰面积比11.05%，含量315.883 8 ng·g-1)、1个酸类(峰面积比0.04%，含量1.082 5 ng·g-1)、4个酯类(峰面积比2.34%，含量66.829 1 ng·g-1)、1个杂环类(峰面积比1.52%，含量43.703 9 ng·g-1)、14个烃类(峰面积比41.12%，含量1 172.338 5 ng·g-1)和6个其他物质(峰面积比6.98%，含量199.488 1 ng·g-1).

表6 ‘肉桂’中匹配率>50%的物质含量Table 6 Substance content with matching ratio >50% in ‘Rougui’ tea

续表6

3 讨论

对茶叶香气物质进行定量分析是研究茶叶品质的重要方法.气相色谱的归一化法通过比较色谱峰面积的大小，可以对谱图内各物质进行相对定量[19].由于不同样品色谱峰的数量和总峰面积的不一致，归一化法对不同茶叶样品进行定量，结果会存在较大偏差.外标法和内标法也是常用的定量方法之一.外标法一般采用正构烷烃(C8～C20)为标样，根据不同分子量的烷烃峰面积，对谱图物质进行定量比较分析，已成为普遍方法之一[8,10-11].茶叶中的香味物质主要是醇类、醛酮类、酸类、酯类和杂环类物质[18,20]，其挥发性与烷烃差异较大，正构烷烃外标法定量也会存在定量误差问题.因此，在茶叶香味物质分析中，选择合适的内标物进行内标法定量，是解决途径之一.内标物必须满足如下条件：(1)保留时间合适，不覆盖样品原有的物质出峰；(2)峰面积适中，对整个谱图的峰面积影响较小；(3)能比较准确地定量整个谱图中的高峰面积和低峰面积物质.本试验选择4-叔丁基环己醇为内标物，对‘肉桂’进行了内标物添加试验研究，结果(图1、表2、表3)表明：4-叔丁基环己醇的出峰时间与前后两个物质的出峰时间相差大于0.17 min，不存在覆盖样品峰的情况；内标物峰面积占总峰面积的比例较小(2.67%)，且具有良好的重复率(相对标准偏差<10%)，满足了内标物的基本要求.此外，通过6个考察目标回收率试验证实，以4-叔丁基环己醇为内标物，对高峰面积物质[如芳樟醇(峰面积147.78×106)]、中等峰面积物质[如2-正戊基呋喃(峰面积67.69×106)、糠醛(峰面积66.29×106)]和低峰面积物质[如戊酸(峰面积1.68×106)、水杨酸甲酯(峰面积8.19×106)、对伞花烃(峰面积14.08×106)]的回收率为80.00%～120.00%，且考察目标涵盖了醇、醛、酸、酯、烃和杂环类物质(表1).因此，4-叔丁基环己醇作为内标物，可以较好地定量分析‘肉桂’中的香味物质.

通过对‘肉桂’不同定量方法的比较，结果(表6)显示，采用归一化法，非香味物质(非萜类烃和其他物质)峰面积百分比为34.13%，占匹配率>50%物质总峰面积的40%以上，超过了任何一类香味物质的峰面积比.显然，仅以峰面积比来对茶叶香味物质相对定量，不能作为不同茶叶之间的香味物质比较依据.而采用内标法定量，由于无贡献物质的存在，不影响各类物质和各个化合物的含量，可以较准确地定量比较不同茶叶之间某类物质或某个化合物的差异.香味物质含量是香型、香强值(阈值)、香比强值和持久性(留香值)等香味评判的重要依据[21-22]，因此准确测定香味物质含量，是比较不同茶叶香味品质的重要前提，内标法是提供此依据的主要方法.已有研究表明，茶叶主要香味物质为醇类、醛酮类、酯类和杂环类等[18].本试验检测结果(表6)显示，‘肉桂’的主要物质有4个单萜芳樟醇类化合物(218.4530 ng·g-1)、倍半萜橙花叔醇(151.529 9 ng·g-1)、(E,E)-2,4-庚二烯醛(76.954 8 ng·g-1)、糠醛(42.597 2 ng·g-1)、3,5-二甲基苯甲醛(34.953 6 ng·g-1)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(62.098 6 ng·g-1)、(Z)-己酸-3-己烯酯(36.679 7 ng·g-1)、2-戊基呋喃(43.703 9 ng·g-1)、倍半萜α-法尼烯(144.590 8 ng·g-1)、2,6,11-三甲基十二烷(80.781 4 ng·g-1)、单萜α-蒎烯(96.642 9 ng·g-1)和罗勒烯(52.498 2 ng·g-1).芳樟醇是茶叶的特征性香气物质之一，是茶叶中重要的呈香成分和香气活性物质，是令人愉悦的高香成分，具有一定的铃兰香气[5,17,23-25].Feng et al[26]检测结果表明，在绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、红茶和黑茶6种茶叶类型中，芳樟醇含量都很高.橙花叔醇作为具有一定花香的芳香物质，对绿茶的栗香具有较大贡献[27]；2,4-庚二烯醛的呈香强度较高，是优质乌龙茶的关键呈香物质之一[5]；糠醛具有焦甜香以及烘烤香的香气特征[28]，作为‘鸭屎香’(广东凤凰单丛品种)红茶加工过程中相对含量变化较大的醛类化合物之一，对红茶“焦糖香”的形成具有一定的促进作用[29]；6-甲基-5-庚烯-2-酮是合成芳樟醇的中间体，具有水果香气和新鲜清香香气[30]；己酸-3-己烯酯有玫瑰香味[31]；2-戊基呋喃香味阈值较低(4.8 ng·g-1)，是茶叶中坚果香的来源之一[32]；α-法尼烯是青茶香气的主要组成部分之一，具有青草香和花香的香气特征[33]，也是茉莉花茶的香气成分之一；α-蒎烯是松节油的主要成分，具有松木和针叶的气味[34]；罗勒烯具有花香并伴有橙花油气息[35].而这些化合物的香味特征及对‘肉桂’香味的贡献度，均需要根据物质的香味评价指标，如阈值、香比强值、留香值等来做评判，这也体现出香味物质含量在深入分析茶叶香味特征的重要性.

诚然，4-叔丁基环己醇不会是茶叶香味物质的唯一内标物.根据茶叶类型和样品的差异，还有很多物质是潜在的内标物候选者.本试验结果表明，4-叔丁基环己醇作为‘肉桂’香味物质的定量内标物，是切实可行的.鉴于我国茶叶类型较多和品种丰富，还需要通过不同类型与品种茶叶样品中的香味物质含量测定与比较分析来确定该内标物的适用范围.选择更多可供茶叶香味物质定量的内标物，是准确定量分析茶叶香味物质的重要基础.