碱性成纤维细胞生长因子调节小鼠慢性移植物抗宿主病的作用及其机制

刘一岚，帅燕蓉，邓 锐，何光翠，缪晓娟，范方毅

（解放军西部战区总医院血液科，四川 成都 610038）

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是部分遗传性疾病或血液系统恶性肿瘤治疗的主要方式，其可使患者后期出现慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）并发症，对患者生活质量造成影响，严重者可导致非复发死亡[1]。近年来移植供应源主要为外周血干细胞和非血缘供者，加之受者年龄上限提高，cGVHD 发病率呈逐年上升趋势[2，3]，因此明确cGVHD 发病机制尤为重要。随着发病机制研究不断深入，发现B 细胞受体相关的信号通路和B 淋巴细胞活化与cGVHD 相关，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是与之相关的治疗方法，其为一群多功能细胞，具有多向分化潜能和自我更新能力，在造血干细胞移植后具有调节免疫级组织修复作用，其作用机制尚不完全明确，但可知与调节性T 细胞和B 细胞有关。目前MSC 来源主要为骨髓或脐带血体外传代培养，具有一定临床疗效，但需要经过多次输注[4，5]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）也为多功能因子，在增殖MSC 方面具有关键作用[6]。本研究通过建立单倍体HSCT 后cGVHD 的小鼠模型，分析bFGF 调节小鼠cGVHD的作用及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 建立单倍体HSCT 后cGVHD 的小鼠模型 购买8～10 周龄雌性C57BL/6 共36 只，实验分组：空白对照组、外源性MSC 治疗组和bFGF 治疗组，每组12只。所有动物均在无菌恒温恒湿条件下饲养。各组老鼠均给予Co605.5 Gy 全身照射的预处理，其次经腹腔输注供体小鼠10×107个脾细胞/只，空白对照组输注0.5 ml RPMI1640 培养液。

1.2 流式细胞术cGVHD 相关免疫细胞检测 将获得的淋巴细胞浓度调1×105/100 μl，吸取100 μl 细胞悬液至流式检测管中行抗体孵化，调节性T 细胞表型以CD4、CD25 标记，4 ℃条件下孵化30 min。孵化完毕后样品给予PBS 清洗以去除多余抗体，重悬于200 μl PBS 液中上机检测，细胞收获总数为1×105，收获速度200～300 cells/s，数据由FlowJo7.6 软件分析完成。

1.3 ELISA 酶联免疫细胞因子检测 血浆层稀释2～5倍。包被：用0.05 mol/L PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 ml，4 ℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3 次，3 min/次。加样：加一定稀释的待检样品0.1 ml 于上述已包被之反应孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。加酶标抗体：于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 h，洗涤。加底物液显色：各反应孔中加入临时配制的TMB 底物溶液0.1 ml，37 ℃10 min。终止反应：于各反应孔中加入2 mol/L 硫酸0.05 ml。结果判定：测O·D 值：在ELISA 检测仪上，于450 nm（若以ABTS 显色，则410 nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D 值，计出相应因子（IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α）浓度。

1.4 观察指标 比较三组cGVHD 临床表现和小鼠生存情况、CD4+和CD25+细胞，并观察间充质干细胞培养结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0 软件包进行数据处理。计量资料以以（）表示，采用方差分析或t检验；计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠生存情况 空白对照组移植后10 d 小鼠开始死亡，17 d 内小鼠全部死亡；对照组移植后13 d小鼠开始死亡，19 d 内小鼠全部死亡；实验组移植后15 d 小鼠开始死亡，其中2 只小鼠生存时间超过30 d。实验组小鼠生存时间多于空白对照组和对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 三组cGVHD 临床症状比较 空白对照组出现上述症状于小鼠移植后8 d；对照组出现上述症状于小鼠移植后8 d；实验组出现上述症状于小鼠移植后10 d。实验组cGVHD 临床症状出现时间晚于对照组和空白对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 三组cGVHD 白细胞计数比较 三组移植后3 d白细胞计数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；三组移植后6、9、12、14、15 d 白细胞计数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和实验组移植后下降速度较慢，空白对照组白细胞计数下降速度较快，且移植后15 d 白细胞计数仍＞0.5×109/L，见表1。

2.4 三组cGVHD 体重减轻情况比较 移植后7 d，空白对照组体重减轻程度高于对照组和实验组，差异有统计学意义（P＜0.05）；移植后14 d，空白对照组、对照组体重减轻程度与对照组体重减轻程度高于实验组，差异无统计学意义（P＞0.05），但空白对照组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.5 三组IL-10、IL-12、TNF-β 和TNF-α 比较 对照组TNF-α、TNF-β 与实验组比较，空白对照组TNFα 与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组IL-10 和IL-12 均高于空白对照组和对照组，TNF-α 高于空白对照组，TNF-β 低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.6 三组CD4+和CD25+细胞比较 实验组CD4+和CD25+细胞水平高于空白对照组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.7 间充质干细胞培养 间充质干细胞培养结果显示，移植后14 d，对照组和空白对照组细胞无法集落和继续生长，而实验组可见大量细胞集落且良好生长，光镜下见细胞呈长梭状且贴壁，细胞核紧密团结，见图1。

3 讨论

cGVHD 为HSCT 治疗后严重并发症，其对患者生命和健康造成较大威胁，如何预防和治疗cGVHD成为临床研究热点和重要课题[7]。目前，细胞疗法为预防和治疗cGVHD 常用方法，其中MSC 最受关注。研究证实[8]，MSC 因对免疫功能和造血细胞增殖、分化及成熟具有调节作用，可有效预防急性移植物抗宿主病（aGVHD），但是否对cGVHD 有效尚不可知。另研究发现[9-11]，MSC 可以抑制混合淋巴细胞反应丝裂原，升高CD8+和CD28-调节性T 细胞亚群比例，促进CD5+调节性B 细胞增殖且抑制其凋亡，提高IL-10 分泌水平，降低血清B 细胞表面受体的表达和B 细胞激活因子（BAFF）水平，诱导免疫耐受。李潇等[12]研究发现，调节性B 细胞在cGVHD 的发病中起重要作用。bFGF 为广谱的有丝分裂原，对血管内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、成肌细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层细胞的增殖分化起刺激和调节作用[13，14]，还可促进血管生成和神经细胞修复，协同其他造血生长因子共同促进造血细胞体外克隆形成。

表1 三组cGVHD 白细胞计数比较（，×109/L）

表1 三组cGVHD 白细胞计数比较（，×109/L）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与实验组比较，bP＜0.05

表2 三组cGVHD 体重减轻情况比较（，g）

表2 三组cGVHD 体重减轻情况比较（，g）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与实验组相比，bP＜0.05

表3 三组IL-10、IL-12、TGF-β 和TNF-α 比较（）

表3 三组IL-10、IL-12、TGF-β 和TNF-α 比较（）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与实验组相比，bP＜0.05

表4 三组CD4+和CD25+细胞比较（，%）

表4 三组CD4+和CD25+细胞比较（，%）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与实验组相比，bP＜0.05

图1 经bFGF 处理的小鼠骨髓间充质干细胞培养结果

本研究通过建立单倍体HSCT 后cGVHD 的小鼠模型，将实验分为空白对照组、对照组（外源性MSC 治疗组）和实验组（bFGF 治疗组）并观察各组小鼠生存情况和cGVHD 临床表现，结果发现实验组小鼠生存时间多于空白对照组和对照组，cGVHD临床症状出现时间晚于对照组和空白对照组，对照组和实验组移植后下降速度较慢，空白对照组白细胞计数下降速度较快，且移植后15 d 时白细胞计数仍＞0.5×109/L，提示注射适量bFGF 对cGVHD 发生起一定延缓作用，对cGVHD 临床症状发生起明显减轻作用，可延长小鼠的生存时间，减少预处理的损害[15-17]。此外，本研究通过对MSC 培养检测，结果发现移植后实验组见大量细胞集落且良好生长，光镜下见细胞呈长梭状且贴壁，细胞核紧密团结，说明实验组培养的细胞为MSC，具备较强的诱导分化能力。本研究发现实验组CD4+和CD25+细胞水平高于空白对照组和对照组，实验组IL-10 和IL-12 均高于空白对照组和对照组，TNF-α 高于空白对照组，TNF-β 低于空白对照组（P＜0.05），提示bFGF 通过增加CD4+和CD25+细胞调节性T 细胞分泌、促进IL-10、IL-12 和TNF-α 分泌和减少TNF-β 分泌，从而对GVHD 发生起延缓作用，证实bFGF 可延缓GVHD 发生时间，稳定造血微环境，减轻预处理的损伤作用，延长小鼠的生存时间，减轻GVHD 严重程度，促进MSC 体内增殖和活性[18-20]。

综上所述，bFGF 对cGVHD 具有调节作用，其通过促进单倍体HSCT 供者来源的间充质干细胞体内增殖，使调节性T 细胞、调节性B 细胞和骨髓来源的抑制细胞增殖，从而调节cGVHD，延缓其发生。