束缚应激对妊娠期大鼠海马突触可塑性的影响*

白华毅，刘婷婷，邓卓凡，何成芸，宋春莲，程美玲

(云南农业大学 动物医学院基础兽医系，云南 昆明 650201)

随着女性社会地位的变化，妊娠期内女性需要面对来自工作、人际交往及家庭生活中各种应激事件，如工作压力、过度焦虑和家庭矛盾等，由此导致的精神疾病如产前抑郁症等发病率不断增高。据报道，国内产前抑郁症的发病率高达4.36%～30.79%[1]，并且每年以9%的速率上升[2]，妊娠期精神疾病的研究受到越来越多国内外研究的重视。据流行病学调查发现：妊娠期内应激使得围生期抑郁症的易感性增加[3]。也有文献表明：妊娠期内应激诱导子代大鼠的抑郁样行为并对其认知功能造成损害[4-5]，因而妊娠期内应激对母代及子代的身心发育都有不良影响。因此，近年来妊娠期应激诱发的精神疾病及其机制研究受到越来越多的关注。目前已有报道表明：长期慢性的应激会对海马造成损害，包括其兴奋性以及神经元形态，严重的会导致神经元死亡，最终影响海马的功能[6-7]。如NIFOSI 等[8]发现：抑郁症患者的大脑海马体积较正常人明显减小；KOLBER等[9]的研究表明：急性应激可提高身体和精神反应，但长期应激反应会导致一系列负面效应，包括损害海马所依赖的认知。突触可塑性包括长时程增强(long-term potentiation，LTP)和长时程抑制(long-term depression，LTD)，被公认为是学习、记忆和情绪等细胞水平的生物学基础。而最近一些研究表明：多种精神疾病的发病起因可能与最早发生的突触可塑性的变化有关，突触可塑性的改变可能是引起后续神经可塑性变化、细胞衰亡和海马萎缩的起因[10-11]。推测妊娠期应激相关精神疾病的发生可能与妊娠期内应激诱发的海马突触可塑性变化有关。目前针对应激对妊娠期内大鼠海马突触可塑性影响的研究尚未见报道。因此，本研究对妊娠期大鼠施行慢性束缚应激，通过经典的人工低频电刺激诱导方案，检测海马突触可塑性长时程抑制(LTD)的改变，为妊娠期精神疾病的发病机制提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SD 雌性大鼠(昆明医科大学实验动物中心提供)，体质量250～280 g，动物单独饲养，12 h/12 h明暗交替，饲养环境温度20～24 ℃，相对湿度40%～66%，任其自由采食与饮水。

1.2 试验材料

20%氨基甲酸乙酯(天津市光复精细化工研究所)，盐酸普鲁卡因(新乡市长乐制药有限责任公司)，颅骨打孔机(自制)，数显脑立体定位仪(安徽正华生物仪器有限公司)，自制电极(2 根拧在一起的铂铱合金电极丝，外部绝缘层为聚酰亚胺，内径50 μm，外径75 μm)，生物信号采集器(Powerlab 4/35 AD Instruments，澳大利亚)，生物信号放大器(DP-311 Differential Amplifire，Warner Instrument，美国)，刺激隔离器(ISO-flex，A.M.P.I.，以色列)。

1.3 妊娠后慢性束缚应激

束缚应激是一种经典的长时慢性应激方案，能较好模拟人类孕期某些活动少、缺少自由、空间狭小等慢性应激的情况。实施方案参照CHIBA等[12]和NAERT 等[13]的研究，具体如下：将雌鼠与雄鼠合笼后于次日清晨检查雌鼠阴道口有无阴栓，将检查到阴栓的雌鼠记为妊娠期0 d，而后将妊娠期5 d 的大鼠每天置于束缚筒内，保持大鼠仅能呼吸运动，每天2 h，连续15 d，束缚应激结束后放回饲养笼。

1.4 电生理试验

1.4.1 手术

束缚应激结束后24 h，用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉大鼠后，进行颅骨暴露手术。固定在立体脑定位仪后通过颅骨开孔将记录电极植入海马CA1 区辐射层(开孔位置为前囱后3.8 mm，中缝旁2.8 mm)，刺激电极植入位置为海马Schaffer 侧枝(开孔位置为前囱后4.8 mm，中缝旁3.8 mm)。

1.4.2 电极植入及记录兴奋性突触后膜电位

将记录电极和刺激电极缓慢同步植入(所给刺激量为4 V，1 ms 刺激方波)，2 根电极植入的深度根据记录电极所记录到的兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)(30 s 记录1 次)达到最大、稳定不再变化，并符合峰值潜伏期(peak latency，通常为10～15 ms)来决定[14]。当满足所有条件后，继续记录10 min，若波形及幅值稳定，则进行下一步操作。

1.4.3 海马突触可塑性检测

为寻求最适刺激量，将所给刺激量依2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 和5.5 V 的梯度进行测试，给予1 ms 刺激方波，记录fEPSP，取fEPSP最大峰值的50%～60%所对应的刺激量为最适刺激量。并稳定记录兴奋性突触后膜电位60 min(30 s 记录1 次)，未超过5%的变化后再进行下一步低频诱导[14]。采用经典低频刺激诱导方案[15](1 Hz，900 pulse)进行诱导。而后刺激量采用测试出的最适刺激量，其他参数均不变，稳定记录兴奋性突触后膜电位60 min (30 s 记录1 次)。

1.5 数据统计

在体电生理试验中，取Powerlab 软件记录到的fEPSP 幅值，把低频诱导(low-frequency stimulate，LFS)后记录到的最后10 min fEPSP 幅值和诱导前记录的fEPSP 的幅值进行统计处理，如果有显著性差异就判定诱导出LTD。试验结果以Origin 9.1 做图，数据以平均值±标准误(mean±SE)表示。用单因素方差分析或者Student’sttest 进行统计处理(SPSS 24)。

2 结果与分析

2.1 妊娠期大鼠海马突触可塑性的变化

结果显示：妊娠大鼠的突触可塑性发生显著改变。采用1 Hz 的低频诱导方案进行诱导，在诱导前后，空白对照组(CTL)大鼠与妊娠组(PRE)大鼠的fEPSP 波形变化示例见图1a。统计结果显示：空白对照组(CTL)大鼠诱导后的fEPSP 值(98.68%±3.64%)与自身基线(101.36%±2.72%)比较，无统计学差异(P＞0.05，图1b)。而未施行束缚应激的妊娠组(PRE)大鼠，诱导前后fEPSP 值的变化见图1b，诱导后(112.64%±4.99%)与自身基线(99.54%±3.94%)比较海马兴奋性突触后电位明显增大，有极显著差异(P＜0.01，图1b)，形成长时程增强(LTP)。

图1 妊娠后低频刺激诱导出LTPFig.1 LTP induced by low frequency stimulation after pregnancy

2.2 妊娠期慢性束缚应激对海马突触可塑性的影响

研究结果表明：妊娠期应激会对海马突触可塑性造成影响。将未妊娠应激组(STR)大鼠经过束缚应激之后，其fEPSP 诱导前后波形示例如图2a 所示，诱导前后变化见图2b，诱导后的fEPSP 值(87.45%±1.85%)与自身基线(96.52%±2.67%)相比，统计学差异极显著(P＜0.01，图2b)，形成长时程抑制(LTD)。而经过束缚应激的妊娠应激组(P+S)大鼠诱导前后波形示例如图2a 所示，诱导后fEPSP 值(103.73%±3.86%)与自身基线(101.78%±1.09%)比较海马兴奋性突触后电位无显著差异(P＞0.05，图2b)。

2.3 4 组大鼠海马突触可塑性变化情况比较

图2 妊娠后应激未诱导出LTDFig.2 Post-pregnancy stress did not induce LTD

图3 低频诱导前后4 组大鼠海马突触可塑性的比较Fig.3 Comparison of synaptic plasticity in hippocampus before and after low frequency induction in four groups of rats

分别统计4 组大鼠在低频诱导前后的fEPSP幅值，诱导前4 组之间的基线无显著差异(P＞0.05，图3a)，即可将4 组在诱导前基线水平视作100%。而经过低频诱导后，4 组间的对比见图3b，将对照组(CTL：8.68%±3.64%)与妊娠组(PRE：112.64%±4.99%)相比，诱导后fEPSP 值有极显著性差异(P＜0.01，ANOVA)；而应激组(STR：87.45%±1.85%)与妊娠应激组(P+S：103.73%±3.86%)相比，诱导后fEPSP 值具有极显著性差异(P＜0.01，ANOVA)。除此之外，本研究还比较了对照组(CTL)与应激组(STR)的差异，两组诱导后fEPSP 值有极显著性差异(P＜0.01，ANOVA)，而应激组(PRE)与妊娠应激组(P+S)相比，诱导后最后10 min fEPSP 值具有极显著性差异(P＜0.01,ANOVA)。

3 讨论

本研究的主要发现是低频电刺激在妊娠大鼠上诱导出长时程增强(LTP)，但在施行慢性束缚应激后的妊娠大鼠上，未诱导出长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)。

首先，本研究所用1 Hz 频率的低频刺激，在未妊娠的空白对照大鼠上不能诱导出LTP 或LTD，却在未妊娠组大鼠上诱导出显著的LTP，表明妊娠后大鼠海马突触可塑性发生了变化。1 Hz 的诱导方案是目前国内外公认的诱导LTD 经典方案，在未应激情况下，不能诱导出LTD[16]，而结果显示：这种1 Hz 诱导方案在妊娠期大鼠上诱导出长时程增强(LTP)。一般来说，人工诱发形成LTP 需要200 Hz 左右的高频率刺激，使位于突触后膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methy-D-aspartate receptor，NMDAr)打开，继而引发一系列包括CaMKⅡ[17]、PKC[18]、cAMP以及ERK/MAPK[19]等胞内信号的变化，才能诱导出LTP。因此，推测在妊娠期大鼠上1 Hz 的低频刺激就可诱发出LTP 的原因可能是妊娠后大鼠的内分泌系统发生了剧烈变化，如妊娠后雌激素和孕激素分泌增多，促使海马突触可塑性相关蛋白的表达发生变化，进而影响海马突触可塑性。而早期在分子和细胞水平的研究发现：雌激素可增强NMDA 通道活性及LTP[20-21]。而后许多研究表明：雌激素参与调节海马突触可塑性的NMDAR的表达，并且可通过Src 介导的信号转导增强NMDA 受体亚基NR2B 的磷酸化[22-23]，磷酸化后可促进LTP 的形成。更有研究发现：雌性大鼠动情前期(雌激素水平最高)海马CA1 区fEPSP 斜率及LTP 增强程度明显高于其他期[24]。因此，本研究提示了妊娠期内激素对海马突触可塑性的调节有明显作用。

已有研究表明：海马对于应激较为敏感，应激后1 Hz 的低频率刺激可诱导出显著的LTD[25]。在本研究中，作为对照的未妊娠鼠应激后，低频刺激可诱导出显著的LTD，这与之前XU 等[25]的有关应激易化LTD 的研究一致。研究结果发现：妊娠后经过应激的大鼠，低频刺激却未诱导出LTD，说明应激使妊娠大鼠的海马突触可塑性发生异常变化，而突触可塑性与NMDAR 亚型的表达，与PKA 和cAMP 等信号分子有关。雌激素与雌激素受体结合后可增加胞内PKA 和cAMP活性，使Ca2+通道磷酸化，Ca2+内流，突触可塑性增强[26]。也可通过调节NMDAR 亚基NR2B 的磷酸化[22-23]，促进LTP 的形成。而应激后，大鼠的下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitaryadrenocortical axis，HPA)激活，使机体内的肾上腺皮质激素水平大幅度增高[27]。肾上腺皮质激素又可通过影响NMDAR 亚基及相关信号分子，影响海马突触可塑性[28]。还有研究表明：肾上腺皮质激素可使海马CA1 区雌激素受体表达下降[29]。因此，推测其原因可能是雌激素与应激所介导的分子信号产生了相互作用，进而影响了海马突触可塑性，其具体机制有待进一步研究。

4 结论

妊娠后大鼠海马突触可塑性增强，妊娠期内慢性应激可损伤单向海马突触可塑性。本研究为妊娠期应激相关精神疾病的发病机制研究提供了重要的神经电生理学依据。