仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌群落结构分析

朱 晗,郝德君,魏原芝,孙丽昕,文全民

(南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

昆虫在长期协同进化过程中，与病毒、细菌、真菌、原生动物等多种微生物相互选择、相互适应，形成了密切的共生关系。研究表明，昆虫肠道细菌具有多方面的功能，如调节营养代谢帮助宿主分解难以降解的食物变为易于消化吸收的组分[1]；直接为宿主昆虫提供必需氨基酸、维生素等营养物质[2]；分解代谢产生短链脂肪酸(SCFAs)等代谢副产物影响宿主昆虫的脂质和碳水化合物代谢，维持稳态[3]；调控激素的信号途径从而影响宿主昆虫的生长发育及其寿命[4]；降解杀虫剂，保护宿主免受毒害[5]；参与肠道干细胞增殖和上皮细胞再生的生理活动[6]；参与昆虫信息素的合成，调控宿主昆虫种间通讯及种群行为[7]；引起宿主昆虫的物种分化[8]；抑制昆虫寄主植物的防御反应[9]等等。

仁扇舟蛾(Closterarestitura)为鳞翅目(Lepidoptera)舟蛾科(Notodontidae)扇舟蛾属(Clostera)，具有世代多、产卵量大、幼虫孵化率高、虫口数量易在短期内剧增等特点[10-11]，是杨树重要的食叶害虫。国外分布于印度、越南、马来西亚和印度尼西亚，国内分布于南方的安徽、江苏、上海、浙江、江西、福建、湖南、广东、云南、海南、台湾和香港等地[10]。近些年，江苏、安徽、上海等地仁扇舟蛾相继爆发成灾，不仅影响了我国重要速生树种——杨树的生长发育，也造成很大程度的生态环境破坏。目前虽然开展了仁扇舟蛾的形态特征[10]、生物学特性[11]、与寄主植物的相互关系[12]以及嗅觉感受蛋白[13]等方面的研究，但未见其肠道共生微生物的研究报道。本研究采用细菌分离培养法，利用16S rDNA基因序列分析和PCR扩增技术，结合菌落形态观察和生理生化特征鉴定肠道中可培养细菌的种类，了解仁扇舟蛾肠道共生细菌的主要类群及其群落结构特征，为进一步研究特异功能细菌的生理生化特征和功能奠定基础，也为探讨肠道菌群对宿主的生理功能和生态学意义提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

仁扇舟蛾2～3龄幼虫采自南京市浦口区乌江镇(118°52′E，31°89′N)杨树行道树，带回实验室后置于光暗周期为14L/10D、温度(25±2) ℃、相对湿度为(65±5)%的条件下饲养，喂食新鲜的杨树叶片，每日更换1次。以实验室饲养的第2代5龄幼虫为供试昆虫。

1.2 肠道解剖及可培养细菌的分离培养

选取10头健康的5龄幼虫，饥饿处理12 h，后用PBS缓冲液冲洗虫体表面多次，置于75%酒精中体表消毒3 min，并用无菌水漂洗3次。无菌环境下解剖肠道，将分离的前、中和后肠分别置于2 mL离心管中，加入PBS缓冲液0.5mL研磨，并于室温下1 000 r/min离心3 min，取上清液，用无菌水分别稀释10-1～10-6倍，涂布于NA和LB固体培养基上。LB固体培养基(1 L)：蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，pH 7.0。NA固体培养基(1 L)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，pH 7.0。重复3次，置于28 ℃恒温培养箱中培养72 h。根据菌落颜色、大小和形态分离纯化单菌落，纯化所得菌株于25%甘油中保存置于-80 ℃备用。

1.3 肠道可培养细菌的形态观察及生理生化实验

利用LB固体培养基培养活化所得菌株，待长出单菌落后观察形态特征，包括：大小、形状、颜色、透明度、表面光滑与否及边缘特点等。观察菌体形态，包括菌体单染、革兰染色、芽孢染色和鞭毛染色等。生理生化性状包括酶活测定、H2S产生、硝酸盐还原、丙二酸盐及柠檬酸盐的利用、IMViC(吲哚实验、甲基红实验、伏-普实验和柠檬酸盐实验)、碳素化合物利用(糖类和醇类)和大分子化合物水解(淀粉、液化明胶和七叶苷水解)等。

1.4 肠道可培养细菌DNA的提取和16S rDNA扩增

活化保存备用的菌种，提取细菌基因组DNA。16S rDNA通用引物：27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′) 和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系为25 μL：ddH2O 17.25 μL，10×TransTaq-T Buffer 2.5 μL，gDNA (50 ng/μL) 2.0 μL，Primer 27 F (10 mmol /L) 和Primer 1492 R(10 mmol /L) 各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，TransTaq-T DNA Polymerase (5 U/μL) 0.25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃保温。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.5 16S rDNA序列系统发育分析

将测序得到的16S rDNA序列用Clustal X 1.82软件进行多序列比对，后与NCBI GenBank数据库进行Blast同源性比对，选取各个菌株的近缘序列，利用MEGA 7.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树，使用Bootstrap检验进化树的可靠性，Bootstrap值为1 000。

2 结果与分析

2.1 肠道可培养细菌的形态特征

研究分离得到仁扇舟蛾5龄幼虫可培养细菌22株，其中前肠5株，中肠10株，后肠7株，对其依次编号为CF1-5、CM1-10和CH1-7。纯化后，22株菌的菌落和菌体形态的观察结果见表1。其中，3株菌的形状为球形，19株为杆状；8株细菌革兰染色呈阴性，14株细菌革兰染色呈阳性；9株细菌有芽孢，8株细菌有荚膜，18株细菌有鞭毛。

表1 仁扇舟蛾幼虫肠道细菌基本特征Table 1 The basic characteristics of intestinal bacteria in the gut of Clostera restitura larval

2.2 肠道可培养细菌的生理生化鉴定及16S rDNA基因片段的扩增与克隆

测定结果表明(表2)，所有菌株对糖醇等碳素化合物的利用差异不显著，均具有较强的分解能力。但不同菌株在酶活测定、H2S产生、硝酸盐还原、丙二酸盐及柠檬酸盐利用等方面具有显著差异，少数菌株在IMViC实验中呈阳性反应。大多数菌株在大分子化合物水解实验中呈阳性反应，可分解利用淀粉、液化明胶、七叶苷、柠檬酸盐以及丙二酸盐，但不能还原硝酸盐且不能产生H2S。

表2 仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌各菌株生理生化性状Table 2 Biochemical characteristics of cultured bacteria in the gut of Clostera restitura larval

以提取的肠道细菌基因组DNA为模板，采用细菌通用引物(27F和1492R)扩增后，通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，条带清晰，且获得的细菌16SrDNA基因片段全长在1 500 bp左右，是实验所需目的片段(图1)。

图1 肠道细菌DNA PCR扩增电泳图谱Fig.1 The electropherogram of the intestinal bacterial DNA PCR amplification

2.3 肠道可培养细菌的系统发育分析

图2 仁扇舟蛾幼虫肠道细菌的16S rDNA的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA phylotypes of the intestinal bacteria of Clostera restitura larvae

将获得的序列提交NCBI GenBank数据库进行Blast同源性比对，将测序得到的仁扇舟蛾幼虫肠道细菌16S rDNA序列进行系统进化分析，结果见图2。结合可培养细菌的形态特征和生理生化指标，鉴定结果如下：前肠5种细菌分别为皮氏罗尔斯顿菌(Ralstoniapickettii)、气球菌属(Aerococcus)、斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)和Exiguobacteriumacetylium；中肠10种细菌分别为极小短小杆菌(Curtobacteriumpusillum)、皮氏罗尔斯顿菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderiaginsengis)、气球菌属(Aerococcus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophlia)、斯氏假单胞菌、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和Paenibacillusuliginis；后肠7种细菌分别为皮氏罗尔斯顿菌、钻特省芽孢杆菌(Bacillusdrentensis)、斯氏假单胞菌、节杆菌属(Arthrobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、寡养单胞菌和瓜两面神菌(Janibactermelonis)。

3 讨 论

采用传统培养法结合16S rDNA分子鉴定技术，研究了仁扇舟蛾5龄幼虫不同肠段的可培养细菌群落结构。结果表明，仁扇舟蛾幼虫肠道内的可培菌种类丰富，其中以变形菌门和厚壁菌门为优势菌群。在同为舟蛾科的栎黄掌舟蛾(Phaleraassimilis)肠道菌的研究中发现其肠道优势菌群也以变形菌门和厚壁菌门为主，以葡萄球菌属和短小杆菌属为主要菌群[14]。在鳞翅目肠道菌群的相关研究中，大多数可培养细菌都属于变形菌门，其中α-变形菌门和γ-变形菌门最为常见；在科水平上，以肠杆菌科、芽孢杆菌科、假单胞菌科、葡萄球菌科、肠球菌科最为常见；在属水平上，假单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属和肠球菌属最为常见[15]。在夜蛾科的相关研究中，变形菌门和厚壁菌门为优势菌群，其中克雷伯氏菌属和沙雷氏菌属为优势菌属[16]。在舞毒蛾(Lymantriadispar)的肠道中发现分离出的70%的细菌属于革兰阳性的γ-变形菌门[17]。

昆虫中肠段作为食物消化和吸收的主要场所，菌群种类和数量相对较高。本研究发现肠道细菌的种类会随着肠段的不同有所差异，如中肠段特有极小短小杆菌、唐菖蒲伯克霍尔德菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和Paenibacillusuliginis。此外，相邻肠段之间往往存在相同的细菌，例如从前肠和中肠中分离出的气球菌属，中肠和后肠共有的寡养单胞菌。前、中和后肠等3个肠段共有的细菌为皮氏罗尔斯顿菌和斯氏假单胞菌。

昆虫肠道菌群不仅与宿主有关，而且与环境、取食的寄主植物有极大的关系。杨树叶片中含有较为丰富的单宁[18]，仁扇舟蛾作为杨树重要的食叶害虫，相关研究表明节杆菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属均可降解单宁[19]。本研究分离到仁扇舟蛾肠道中的这些细菌可能在克服植物次生代谢物质的化学防御上发挥重要作用。

综上所述，本研究首次分析了仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌的种类与群落结构组成。这些细菌可能在提高宿主昆虫对环境的适应性、为宿主提供营养和降解外源有毒物质等方面发挥作用，相关功能有待后续研究。