不同溶剂提取穇子多酚的抗氧化性及对龙眼保鲜作用的研究

王嘉琪 王 乐 马丽娅 李 彦 李赤翎

(长沙理工大学化学与食品工程学院1，长沙 410007) (内蒙古红太阳食品有限公司2，呼和浩特 010000)

龙眼(DimocarpusLongyanLour)，原产于我国南部地区，生长在南亚热带地区，喜温暖湿润气候[1, 2]。龙眼在中医上有很多功效，龙眼核中有大量的黄酮，具有抗氧化、抗心脑血管疾病、降糖降脂、调节免疫力等作用[3, 4]。目前，国内外在龙眼保鲜研究方面都取得了明显的效果。李少华等[5]发现气调冷藏比普通冷藏具有更好的保鲜效果；李亚娜等[6]通过ε-PL/PVA复合膜对龙眼进行保鲜，提高了龙眼果实的好果率，抑制了果皮褐变指数和果肉自溶指数等；Viswanath等[7]研究了穇子多酚的抗菌作用,表明穇子多酚可以抑制金黄色葡萄球菌，肠膜亮肠球菌等微生物；邱瑞瑾等[8]研究了不同浓度的茶多酚溶液均可提高龙眼果实贮藏期间的好果率和可溶性固形物的含量。

穇子多酚具有较强的抗氧化性[9, 10]，且安全无污染无毒性，可以作为天然保鲜剂的良好来源。但穇子多酚应用于果蔬保鲜的研究鲜见报道，本研究通过比较不同溶剂提取穇子多酚的抗氧化性，选出具有较强抗氧化性的穇子多酚，将其与茶多酚和VC进行了保鲜效果比较，以探究穇子多酚的实际抑菌保鲜能力。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

穇子多酚；无水碳酸钠(AR)、福林酚、水杨酸钠(AR)、DPPH自由基、抗坏血酸(AR)、BHT、过氧化氢、铁氰化钾(AR)、三氯化铁(AR)、茶多酚(纯度90%以上)、氢氧化钠、盐酸、草酸、2,6-二氯酚靛酚。

1.2 仪器与设备

YP-B10001电子天平，AVY120电子分析天平，S22pc可见分光光度计，DELTA320 pH仪，YRE-2000B恒温水浴锅，BS-1E恒温培养箱。

2 方法与过程

2.1 穇子多酚的制备

取粉碎过筛后的穇子皮，分别用甲醇、乙醇、酸性甲醇和酸性乙醇为提取溶剂，在80 ℃的恒温水浴锅中浸提50 min，抽滤，得到粗提液，用旋转蒸发仪对其进行浓缩，3 000 r/min离心10 min，取上清液，将上清液以2 mL/min的速度进行洗脱纯化，用70%的乙醇进行洗脱，将收集的溶液进行旋蒸，真空冷冻干燥得到多酚样品。

2.2 穇子多酚抗氧化活性的测定

2.2.1 清除DPPH自由基能力的测定

参考张赟彬[11]的方法略作修改，分别取不同质量浓度的穇子多酚溶液与DPPH乙醇溶液充分混合，室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度值(Ai)。超纯水为空白对照(A0)，相同梯度的VC、BHT为阳性组，以同样方法测定吸光度。按照(1)式计算DPPH自由基的清除能力。

ηDPPH=(1-Ai/A0) ×100%

(1)

2.2.2 铁离子还原能力测定

分别取不同质量浓度的穇子多酚溶液，PBS和铁氰化钾(1%)按顺序加入并混匀，50 ℃恒温水浴反应20 min，待冷却至室温后加入2.5 mL三氯乙酸(10%)，4 000 r/min离心10 min；取4.0 mL上清液和4.0 mL去离子水，再加入0.4 mL FeCl3溶液(0.1%)充分混匀，用去离子水调零。室温下避光反应10 min，700 nm测定吸光度值。同浓度范围的 VC、BHT 溶液为阳性对照组，以同样方法测定吸光值。吸光度的高低表示穇子多酚物质还原能力的强弱。

2.2.3 羟基自由基的清除能力

采用水杨酸法[12]进行测定，分别取用不同浓度的穇子多酚溶液，2.00 mL的水杨酸钠(9 mmol/L)、2.0 mL的 FeSO4(9 mmol/L)和2.0 mL H2O2(0.01%)依次加入，混合均匀后恒温水浴30 min。以去离子水调零，在520 nm测定其吸光度(A2)，以去离子水代替过氧化氢作为对比测定吸光度(A1)，以超纯水为空白组测定吸光度大小(A0)。按照(2)计算羟基自由基清除能力(η·OH)。相同浓度梯度的 VC 和 BHT 作为对照组。

η·OH=[1-(A2-A1)/A0]×100%

(2)

2.3 穇子多酚保鲜作用的研究

2.3.1 实验处理

2.3.1.1 配制溶液

将不同溶剂提取的穇子多酚溶液进行浓缩、冷冻干燥，再分别取不同溶剂提取的穇子多酚、茶多酚和VC，用超纯水进行稀释，分别得到10、20、30 mg/L的穇子多酚溶液，茶多酚和VC溶液。

2.3.1.2 样品处理

设置对照(清水处理)和不同溶剂提取的穇子多酚溶液、茶多酚和VC进行处理，取质量相同、形状与生理状态相似的龙眼，分别在不同溶剂提取的穇子多酚溶液、茶多酚溶液、VC溶液中浸泡10 min，取出，再按照不同处理组别，分别装入塑料袋中，放置在25 ℃恒温箱中，测量其质量变化并观察外形。

2.3.2 龙眼表形指数测定

2.3.2.1 失重率

失重率= (贮藏前果实质量-贮藏后果实质量)/贮藏前果实质量×100%

2.3.2.2 腐烂率

袋中所处理的龙眼以果皮完好无损、手捏不软、无褐变、无腐烂、不流汁为完好果实，剩余果实为腐烂果实，腐烂果实占所调查果实总数的百分比为腐烂率。

腐烂率=(腐烂果实数/调查果实数)×100%

2.3.2.3 可滴定酸含量

采用酸碱中和滴定法测定。每次测定时，分别取经过不同处理过的龙眼，去皮去核，将果肉榨汁，经4层纱布过滤后，将果汁搅拌均匀，用0.005 mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定。

可滴定酸=(V×C×K/M)×100%

式中：V表示消耗氢氧化钠的体积/L；C表示氢氧化钠溶液的浓度/mol/L；K为苹果酸换算系数(0.067)；M表示测定时的果汁质量/g。

2.3.2.4 VC含量的测定

参考《生化实验技术与实施教程》[13]，利用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定VC含量，分别取50 g经过不同处理的龙眼，加入2%的草酸50 mL，榨汁过滤，搅拌均匀。分别吸取样液10 mL，加入16 mL 1%的草酸溶液，用2,6-二氯酚靛酚溶液进行滴定，直至粉红色出现且15 s不消失；另取10 mL1%的草酸做空白对照。计算每100 g样品中抗坏血酸的量(mg/100 g)=[(V1-V2) ×K×V]/(V3×W)

式中：V1为滴定样液所用染料的体积/mL；V2为滴定空白所用染料的体积/mL；V3为样品测定时所用滤液的体积/mL；V为样品提取液稀释的总体积/mL；K为1 mL的2,6-二氯酚靛酚溶液所能氧化的抗坏血酸的量/mg/mL；W为10 mL的样液相当于样品的质量。

2.3.2.5 还原糖含量的测定

取粉碎果肉1 g 于三角瓶中，加入30 mL 水，沸水浴浸提20 min，冷却后定容至50 mL，过滤，留取滤液备用。试管中加样液(即滤液)0.1 mL、DNS 试剂0.5 mL 和水0.4 mL，沸水中煮5 min，冷却后加4 mL 水，以水代替样液作对照，测定540 nm处的吸光度值。由标准曲线查得葡萄糖质量，并计算浓度。

2.3.2.6 总糖含量的测定

取粉碎果肉1 g 于三角瓶中，加入10 mL 浓度为6 mol/L 的盐酸，于沸水浴上浸提30 min，冷却后用6 mol/L 的NaOH 溶液调节pH值至中性，定容至50 mL，然后过滤，留取滤液备用。总糖含量的测定方法同还原糖。

2.3.3 实验数据统计与分析

每组实验重复3次，实验数据采用Microsoft Excel 2016进行处理、计算，使用SPSS 22.0进行描述性统计分析，图表采用Origin 9.0进行绘制。

3 结果与分析

3.1 穇子多酚的组分

采用Diamonsil C18色谱柱对4种不同溶剂提取的穇子多酚进行高效液相色谱分析，得到四种穇子多酚的含量及组分如表1。

表1 四种溶剂提取的穇子多酚物质HPLC分析/mg/g

3.2 穇子多酚抗氧化活性的测定

3.2.1 清除DPPH自由基的能力

不同提取条件的穇子多酚和对照组VC、BHT清除DPPH自由基的能力如图1所示。不同提取条件下的穇子多酚、VC和BHT清除DPPH自由基的能力，随着浓度的上升而增强。总体来看，除酸性甲醇提取的多酚之外，其他3种多酚的清除能力均高于BHT，但都比VC的清除能力弱；其中酸性乙醇提取的多酚的清除效果最好，是因为多酚中含有酚酸，呈弱酸性，酸性条件下更易提取[14]。综合来说，穇子多酚具有较好的抗氧化能力。

图1 穇子多酚、BHT、VC对DPPH自由基的清除效果

3.2.2 还原能力的测定

由图 2可知，4种不同溶剂提取的多酚样品包括BHT和VC，在测定的浓度范围内的还原能力,随着浓度升高逐渐加强。除甲醇提取的穇子多酚样品的还原铁离子能力大于VC，弱于BHT外，其他3种样品均不如BHT、VC的还原能力，出现这种现象的原因是甲醇提取的穇子多酚更易释放出氢与环境中的自由基相结合，从而终止了氧化反应的发生[15]。综合来说，穇子多酚具有良好的还原铁离子能力，即有较好的抗氧化活性。

图2 穇子多酚、BHT、VC还原能力的测定

3.2.3 清除羟基自由基的能力

图3为穇子多酚、BHT和VC清除羟基自由基的结果。4种多酚样品包括BHT、VC，在整个浓度范围内，清除羟基自由基的效果随着浓度的上升而增强。总体来说，4个样品的羟基自由基清除率都不及VC和BHT，其中，酸性乙醇的消除能力在梯度范围内均高于其余3个样品，且当其浓度增大到一定程度时，清除羟基自由基的能力已经接近甚至超过BHT。由此看出，穇子多酚有较好的羟基自由基清除能力，有一定的抗氧化能力。

图3 穇子多酚、BHT、VC清除羟基自由基能力的测定

3.3 穇子多酚保鲜作用的测定

3.3.1 失重率

即使龙眼果实被采摘，它们仍具有一定的生理活动，会通过果皮呼吸，并因蒸气压差而引起水分损失[16]。由表2可知，不同溶剂提取多酚物质处理的龙眼质量变化的趋势基本一致，质量损失率随着贮藏时间的增加逐渐变大。贮藏期间，经过VC处理的龙眼失重率最少，显著低于其他3种；经过穇子多酚的处理中，又以酸性乙醇提取的穇子多酚处理后的龙眼较好，由表1可以看出，可能是由于酸性乙醇相较于酸性甲醇提取出较多的多酚活性物质，保鲜效果较好。

表2 不同样品失重率的变化/%

3.3.2 腐败率

由表3可知，总体来说，随着贮藏时间的增加，龙眼果实的腐败率显著上升。经过4种不同处理后，VC处理的龙眼果实腐败率显著低于其他3种，随着多酚浓度的增加，不同处理的龙眼腐败率差异不显著。整体来看，酸性乙醇提取的穇子多酚和酸性甲醇提取的穇子多酚处理的样品,其防腐效果接近茶多酚和VC。因多酚中含有大量的酚酸，呈弱酸性[17]，因此在酸性条件下比较稳定，表现出较好的活性，具有较好的保鲜能力。

表3 不同样品腐败率的变化/%

3.3.3 可滴定酸含量

由表4可得，龙眼果实在贮藏期间，可滴定酸含量随着时间的增加显著下降，但从第6天开始，下降速度明显减慢；可滴定酸含量随着浓度的增加逐渐增多。总体来看，经过酸性乙醇处理的龙眼果实可滴定酸含量显著高于其余3组，保鲜作用依次为：酸性乙醇提取的穇子多酚>VC>酸性甲醇提取的穇子多酚>茶多酚。

表4 不同样品可滴定酸含量的变化/%

3.3.4 VC含量的测定

VC极易氧化，保护VC不被氧化成为贮藏龙眼的关键。龙眼果实在贮藏期间的变化，由表5可以看出，随着贮藏天数的延长，龙眼果实VC含量显著降低。不同溶剂提取的穇子多酚保护VC的能力虽不及茶多酚和抗坏血酸，但差异并不显著。

表5 不同样品VC含量的变化/%

3.3.5 还原糖含量

观察表6可知，经过不同处理后，龙眼果实的还原糖含量随着天数的增加显著下降，但随着浓度的增大逐渐增大，各浓度之间的还原糖含量差异显著。酸性乙醇和酸性甲醇提取的穇子皮多酚对龙眼果实的保鲜效果差异不显著，接近于茶多酚和VC。龙眼中还原糖含量的降低，可导致龙眼果实风味被破坏，加入穇子多酚可减缓龙眼中还原糖的反应。

表6 不同样品还原糖含量的变化/%

3.3.6 总糖含量

由表7可以看出，贮藏过程中，经过不同处理的龙眼果实的总糖含量差异显著，但变化趋势基本一致，随着天数的增加逐渐增长。经过VC处理后的效果显著高于其他3种，其次为茶多酚、酸性乙醇提取的穇子多酚和酸性甲醇提取的穇子多酚，保鲜效果接近VC和茶多酚。

表7 不同样品总糖含量的变化/%

4 结论

研究不同溶剂提取的穇子多酚的抗氧化性，与VC和BHT相比较，穇子多酚具有良好的自由基清除能力。涂抹穇子多酚、茶多酚和VC后，延缓了龙眼的生命代谢活动，龙眼果实的外形指数表征均有一定的改善，穇子多酚具有良好的保鲜性能，且采用酸性乙醇提取的穇子多酚，配制成30 mg/mL时的保鲜效果最佳。