Th17/Treg在糜烂性口腔黏膜疾病患者的表达水平及其对黏膜病损发展的意义

张金玲，何 旭，黄吉燕

（上海中医药大学附属曙光医院口腔科，上海 200135）

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是临床常见的一种口腔黏膜疾病，目前发病机制尚不明确，可能与遗传、免疫等多种因素有关。OLP病理表现为上皮细胞固有层存在大量淋巴细胞浸润，因此OLP的发病机制与T淋巴细胞介导的免疫反应密切相关［1-2］。辅助性T细胞 17（T helper cell 17，Th17）能通过释放多种促炎因子如IL-17等参与免疫反应，而调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）能表达叉头状转录因子 3（forkheadtranscription factor p3，Foxp3），通过释放多种抗炎因子如转化生长因子 -β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）等发挥作用［3］。目前Th17/Treg平衡在多种自身免疫疾病的发生发展中起到重要作用，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。多项研究表明，Th17和Treg细胞均参与了OLP发生和发展过程，但目前研究报道多围绕病损组织中的表达，而对其在外周血中的表达及作用研究较少［4］。因此本次研究以我院收治的300例OLP患者为研究对象，探究糜烂性OLP患者外周血Th17/Treg表达水平及其对黏膜病损发展的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年1月～2019年2月我院收治的300例OLP患者，纳入标准：（1）患者确诊为OLP，参考《口腔扁平苔藓诊疗指南（试行）》［5］，可分为糜烂型和非糜烂型：①非糜烂型OLP表现为白色斑纹、丘疹或伴随轻度充血，体征评分≤2分，无明显症状。②糜烂型OLP表现为白色网纹间和病损周围伴随充血萎缩糜烂，体征评分＞3分，伴有自发疼痛；（2）近期未使用过抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素等药物；（3）患者知情并签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他免疫系统疾病，如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎等；（2）合并牙周炎、白斑等其他口腔疾病或存在皮损等；（3）合并高血压、糖尿病、等基础代谢疾病；（4）合并艾滋病、乙肝等感染性疾病。300例入选患者中糜烂型有124例，男54例，女70例，年龄（45.2±12.0）岁；非糜烂型有176例，其中男75例，女101例，年龄（44.8±11.7）岁，对照组150例，其中男63例，女87例，年龄（44.6±11.5）岁。各组患者年龄、性别等一般资料比较无显著差异（P＞0.05）。本次研究提交我院医学伦理委员会审核并通过。

1.2 方法入院后抽取患者及志愿者空腹静脉血，离心取上清液，采用流式细胞仪（BD公司，FACSCalibur型）检测各组外周血Th17细胞和Treg细胞水平，采用ELISA检测外周血IL-17、TGF-β1水平（试剂盒来自于美国RD公司），采用荧光定量PCR仪（美国伯乐公司，T100型）检测各组外周血单个核细胞中转录因子RORc、Foxp3 mRNA水平。以β-actin作为内参，RORc：上游5'-GTGCTGGTTAGGATGTGCCG-3'，下游5'-GTG GGAGAAGTCAAAGATGGA-3'；Foxp3上5'-AGAAGCA GCGGACACTCAATG-3'，下游 5'-GACTCAGGTTGTGGC GGATG-3'；β-actin ：上游 5'-TAGTTGCGTTACACCCTT TCTTG -3'，下游 5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT -3'，产物长度分别为135bp、108bp和151bp，，所有操作严格按照说明书进行。

1.3 观察指标和疗效判定体征及REA评分参考《口腔扁平苔藓（萎缩型、糜烂型）疗效评价标准（试行）》［6］。REA评分：糜烂型者无糜烂病损0分，糜烂面低于1cm2者1分，糜烂面在1～3 cm2之间者2分，糜烂面在3 cm2以上者3分；充血萎缩者，无病损0分，充血萎缩面低于1cm2者1分，充血萎缩面在1～3 cm2之间者2分，充血萎缩面在3 cm2以上者3分；网纹病损者，无白色条纹0分，有条纹或丘疹1分。体征评分：无病损0分，轻微白色条纹1分，白色条纹伴随充血或萎缩面＜1 cm2者2分，白色条纹合并充血或萎缩面＞1 cm2者3分，白色条纹伴随糜烂面＜1 cm2者4分，白色条纹伴随糜烂面 ＞1 cm2者5分。

1.4 统计方法采用SPSS 22.0统计软件包对数据进行统计分析，符合正态分布计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以百分率“%”表示，组间比较采用四格表法χ2检验。记P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血Th17、Treg细胞比较OLP患者外周血Th17细胞、Treg细胞水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），但非糜烂型OLP的Th17/Treg比值与正常组无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 各组外周血Th17/Treg比较［n（%）］

2.2 各组外周血IL-17、TGF-β1水平比较OLP患者外周血IL-17水平均高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），但TGF-β1组间两两比较无显著差异（P＞0.05），见表2。

表2 各组外周血IL-17、TGF-β1水平比较

2.3 各组RORc mRNA、Foxp3mRNA相对表达量比较OLP患者RORc mRNA、Foxp3mRNA相对表达量高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05），但非糜烂型OLP 与正常组RORc mRNA/Foxp3mRNA比值组间比较差异无统计学意义，见表3。

2.4 各组体征及RAE评分比较糜烂型OLP患者体征及RAE评分均高于非糜烂型OLP，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 各组RORc mRNA、Foxp3mRNA相对表达量比较

表4 各组体征及RAE评分比较

2.5 RORc mRNA、Foxp3mRNA表达水平与体征及RAE评分的相关性Spearman相关性分析显示，RORcmRNA与体征、RAE评分呈正相关（r=0.71，0.84，P＜0.05）RORc mRNA/Foxp3 mRNA也与体征、RAE评分均呈正相关（r=0.63，0.50，P＜0.05），且RORc mRNA与Foxp3mRNA呈正相关（r=0.58，P＜0.05），见表5。

表5 RORc、Foxp3mRNA表达水平与体征及RAE评分的相关性

3 讨论

OLP是以T淋巴细胞浸润为主要表现的慢性炎症反应疾病，是口腔科常见口腔黏膜疾病，主要涉及峡部、舌、牙龈等部位病变［7］。OLP根据病损表现可分为多种表型，目前国内外学者常将OLP分为糜烂型和非糜烂型，糜烂型OLP病损较非糜烂型更为严重，且随病程迁延，会造成患者语言功能障碍甚至癌变［8］，对患者生存质量和健康造成较大威胁。OLP目前病因及发病机制尚不明确，可能与免疫、感染、遗传等多种因素有关，而T淋巴细胞介导的免疫炎症反应在其中起到了重要作用。

Th17细胞是一种辅助性T淋巴细胞，可由初始CD4+T细胞分化而来。CD4+T细胞可在多种细胞因子作用下被病原体激活，分化为Th17和Treg细胞亚群，而Th17/Treg平衡对机体免疫状态具有重要意义［9-10］。Th17细胞以分泌细胞因子IL-17为特征，具有促炎作用并与体内多种免疫疾病有关，如系统性红斑狼疮、多发性硬化症等疾病患者体内均检出外周血Th17细胞数目的异常增加。田原野等人［11］研究发现，IL-17在OLP病损组织高度表达。本次研究中发现，糜烂型OLP患者外周血中IL-17水平明显高于非糜烂型组和正常组，与上述研究报道一致。但孙倩倩等人［12］研究发现，分泌IL-17的T细胞亚群在OLP中有增高趋势，但与正常对照组比较无显著差异，因此认为Th17细胞可能只参与了OLP致病过程。基于以上不同观点，本次研究通过荧光定量PCR检测了Th17特异性转录因子RORc的mRNA水平，发现OLP患者RORc mRNA相对表达量明显高于正常组，表明Th17细胞同样参与了OLP局部病理反应过程。

Treg细胞在功能上与Th17细胞表现为拮抗作用，对自身免疫反应及免疫疾病的发生具有抑制作用［13］。Treg细胞可分为天然型和外周诱导型两种，主要通过表面抑制性分子作用于效应T细胞，或分泌多种细胞因子如TGF-β1、IL-10等抑制效应T细胞，NK杀伤细胞等的活化和增殖，因此自身免疫疾病患者普遍存在Treg细胞数目降低和（或）功能不全［14-16］。而其特异性转录因子Foxp3，在Treg细胞发育增殖及维持功能方面具有重要作用。Foxp3可结合RORc并抑制其功能作用，从而抑制IL-17的表达水平，从而发挥抗炎作用［17］。本次研究中发现，OLP患者外周血单个核细胞中Foxp3表达水平上调，高于正常组，提示Treg细胞也参与了OLP炎症反应过程，并在其中起到免疫抑制作用。

单独的Th17细胞和Treg细胞水平无法反映机体实际的免疫状态，将两者进行比较发现，Th17细胞和Treg细胞数目呈正相关，有研究发现，Th17细胞的特异性转录因子RORc可协同其他转录因子参与Th17分化及功能调节，同时Treg细胞分泌的细胞因子如TGF-β1同样参与了Th17细胞的分化过程［18］。推测Th17细胞可能起到Treg细胞的效应T细胞作用，而Treg细胞数目的增加可能通过负反馈调节来抑制IL-17水平升高从而起到抗炎作用［19］。本次研究还发现，糜烂型OLP患者体内RORc/Foxp3比值高于非糜烂型OLP和正常组，提示Th17/Treg失衡参与了糜烂型OLP发病过程，但在非糜烂型OLP中变化不明显。Spearman相关性分析显示，RORcmRNA、RORc mRNA/Foxp3 mRNA 比值与体征和RAE评分呈正相关，推测Th17/Treg失衡可能通过加重炎症反应强度从而在OLP发病过程起到重要作用［20］。

OLP患者外周血中Th17和Treg细胞均处于高水平，但在非糜烂型OLP中Th17/Treg保持平衡，而在糜烂型OLP中存在以Th17为优势的Th17/Treg失衡，推测该失衡在OLP病损形成中起到了重要作用。