超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法同时检验全血中5种4-取代卡西酮类结构类似物

徐 琳, 倪春芳, 何洪源*, 赵海波, 刘 静, 顾海硕

(1.中国人民公安大学侦查学院, 北京 100038; 2.上海市公安局物证鉴定中心, 上海 200083; 3.中国人民公安大学信息网络安全学院, 北京 100038)

卡西酮是从阿拉伯茶中分离出来的天然生物碱,其结构及药理作用与苯丙胺类兴奋剂类似,是一种中枢神经系统兴奋剂,食用后短时间内产生兴奋作用,早期常用作抗抑郁药物,用于医药卫生领域[1]。卡西酮类物质的母体为卡西酮[2],通过在芳环的取代基、α碳和氨基等位置上进行修饰[3],可合成出数百种化合物[1],因此存在许多结构类似物。随着药物的替代品越来越多进入毒品市场,此类物质目前已成为近年来滥用最广泛的新型毒品之一[4],为逃避监管和打击,不法分子通过不断变化其化学结构在网上出售,目前中外已有多起此类中毒致死案例发生。

全血样品是常见毒品分析的重要基质,中外检验全血中卡西酮类物质的最新研究方法主要有液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS)[5-6]、气相色谱串联质谱法(gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS)[7]、超高效超临界色谱-单四极杆质谱法(ultra efficient supercritical gas chromatography single quadrupole mass spectrometry,UPSFC-QDa)[8]、气相色谱-真空紫外检测法(gas chromatography-vacuum ultraviolet,GC-VUV)[9]、拉曼光谱法(Raman)[10]和气相色谱-红外光谱法(gas chromatography-infrard spectrum,GC-IR)[11]等。对于同位置不同取代基团的卡西酮类物质在化学结构和物理化学特征性质上极为相似,如何对这些结构类似物进行准确分析,是法庭科学研究的热点和难点问题,虽然超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)技术分辨率高、鉴别能力强、分析速度快,非常适用于检测多种卡西酮类结构类似物,但是目前中外尚未见相关报道。因此,选取4-甲基甲卡西酮(4-methylmethcathinone,4-MMC)、4-氟甲卡西酮[1-(4-fluorophenyl)-2-methylami-nopropan-1-one,4-FMC]、4-氯甲卡西酮[1-(4-chlorophenyl)-2-(methylamino)propan-1-one,4-CMC]、4-溴甲卡西酮[1-(4-bromophenyl)-2-me-thylaminopropan-1-one,4-BMC]、4-甲氧基甲卡西酮[1-(4-methoxyphenyl)-2-methylaminopr-opan-1-one,Methedrone]5种同位置不同取代基团的毒品,建立UPLC-QTOF-MS分析全血中5种卡西酮类结构类似物的方法,对新型毒品的法庭鉴定提供可靠依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Vion IMS QTof型超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱系统(美国 Waters 公司)； Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；Vortex-genie2型涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司)；Millipore TANKPE030 超纯水处理系统(美国 Millipore 公司)。4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone标准品(上海市公安局)；空白全血(上海市公安局)；甲醇、乙腈(色谱纯),甲酸、乙酸铵(分析纯)。5种毒品化学结构式如图1所示。

分别准确称取10.0 mg的4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone标准品,采用甲醇溶解定容至10.0 mL,充分振荡摇匀后,分别配制成1.00 mg/mL的标准储备液。

取1.00 mg/mL 4-MMC、1.00 mg/mL 4-FMC、1.00 mg/mL 4-CMC、1.00 mg/mL 4-BMC、Methedrone各200 μL配成100 μg/mL混标标准储备液,放入4 ℃冰箱中,根据所需取甲醇稀释。

1.2 样品前处理

室温下,取0.5 mL全血,加入0.2 mL纯水,加入10 μL不同浓度混标标准储备液,再加入1.3 mL乙腈，震荡1 min,使得毒品与全血完全混合,在5 ℃下12 000 r/min离心7 min。离心结束之后,取上清液待用。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流动相A1为纯水和0.1%甲酸,流动相B1为乙腈和0.1%甲酸,流动相A2为纯水,流动相B2为乙腈；流速为0.4 mL/min；进样量为1 μL；柱温40 ℃。流动相的梯度洗脱程序如表1所示。

表1 5种毒品的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure for five drugs

1.3.2 质谱条件

毛细管电压:0.5 kV；锥孔气流量:50 L/h；锥孔电压:40 V；源温度:120 ℃；柱温:40 ℃；样品温度:20 ℃；脱溶剂气温度:550 ℃；脱溶剂气体流速:800 L/h；电喷雾电离(ESI),正离子扫描,多反映检测模式(MRM)。质谱参数如表2所示。

表2 5种毒品的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of five drugs

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验对比了流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)、0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)、0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)时各组的分离结果,结果显示,当流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈,各目标物分离效果和响应最好。在较低浓度下,根据3种体系的峰型和稳定性,最终选择0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈作为流动相。5种毒品的MRM色谱图和混标总离子谱图分别如图2、图3所示。

图2 5种毒品的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of five drugs

图3 5种毒品的混标总离子色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of five drugs with mixed standard

2.2 质谱条件的考察

5种毒品100 ng/mL的混合标准品溶液在1.3节实验条件下,采用质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进样分析,在正离子(ESI+)模式下,得到5种毒品的准分子离子峰,同时优化锥孔电压。准分子离子作为母离子,进行二级质谱扫描,选择丰度较高的2个子离子与母离子分别组成离子对,定量离子对为离子强度最大的离子对。提高了检测的灵敏度,可准确定性。5种毒品质谱图如图4所示。

m/z为质子数与电荷数比图4 5种毒品的质谱图Fig.4 Mass spectra of five drugs

2.3 标准曲线、检出限及定量限

取7份0.5 mL空白全血,每份加入0.2 mL纯水,再分别加入10 μL不同浓度混标标准储备液,最后加入1.3 mL乙腈,配制成2、5、10、50、100、200、500 ng/mL的混标标准溶液。每种浓度配制3组,每组进样两次,以不同浓度混标标准溶液峰面积平均值y对浓度x(ng/mL),以1/x为权重进行线性拟合,得到线性回归方程、相关系数。以3倍信噪比计算4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone的检出限(信噪比S/N≥3),以10倍信噪比计算4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone的定量限(S/N≥10)。5种毒品的线性范围在2～500 ng/mL良好,相关系数为0.999 0～0.999 7，检出限为0.5～1 ng/mL；定量限1～2 ng/mL，结果如表3所示。

表3 5种毒品的线性方程、检出限和定量限Table 3 Linear equation, detection limit and limit of quantification for five drugs

2.4 基质效应

取3种来源不同的空白全血,每种取3份,按照1.2节进行样品前处理(取0.5 mL全血,加入0.2 mL水,加入1.3 mL乙腈,振荡离心取上清液)后,加入不同浓度的混标标准储备液,配制成3种高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)浓度的标准溶液,测得全血进行前处理后添加的标准溶液色谱峰面积平均值(S1)。取乙腈配制成3种高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)浓度的标准溶液各3份,测得标准品溶液色谱峰面积平均值(S2),基质效应=S1/S2，结果如表4所示。

表4 5种毒品的基质效应Table 4 Matrix effect of five drugs

2.5 回收率、精密度

取3种来源不同的空白全血,每种取3份(0.5 mL),按照1.2节样品前处理方法加入0.2 mL纯水,加入10 μL不同浓度混标标准储备液,再加入1.3 mL乙腈,配制成3种高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)浓度的标准溶液,振荡离心取上清液,平行测3次并记录峰面积,测得全血中添加标准溶液后进行前处理的色谱峰面积平均值为S3,回收率=S3/S1,结果如表5所示。

另取3种来源不同的空白全血,每种取3份(0.5 mL),按照1.2节样品前处理方法加入0.2 mL纯水,加入10 μL不同浓度混标标准储备液,再加入1.3 mL乙腈,配制成3种高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)浓度的标准溶液,振荡离心取上清液,日内平行测定5次,日间每天测定1次,共测5 d并记录峰面积,结果如表5所示。

表5 5种毒品的回收率、精密度Table 5 Recovery rate and precision of five drugs

2.6 案例应用

将所建立的检验方法用于实际案例中,取两只雄性成年大鼠(7～8周),购自上海杰思捷实验动物有限公司,分别编号为1、2,体重分别为155、160 g。1号大鼠为空白对照,向2号大鼠投喂掺入未知浓度混标毒品溶液的食物。两小时后取1、2号大鼠血液,将血液进行检验。采用上述实验条件和方法,可在2号大鼠血液中检出4-MMC的浓度为4.16 ng/mL,定量离子m/z为160.112 72,保留时间为2.61 min；检出4-FMC的浓度为4.71 ng/mL,定量离子m/z为164.087 36,保留时间为2.36 min；检出4-CMC的浓度为4.63 ng/mL,定量离子m/z为180.058 19,保留时间为2.71 min；检出4-BMC的浓度为3.89 ng/mL,定量离子m/z为145.089 13,保留时间为2.80 min；检出Methedrone浓度为4.27 ng/mL,定量离子m/z为176.108 19,保留时间为2.46 min。色谱图如图5所示。1号大鼠血液中未检验出毒品。由此表明本实验建立的方法可实现对全血检材中的卡西酮类结构类似物进行检验。

图5 2号大鼠检出毒品的色谱图Fig.5 Chromatogram of drug detection in rat 2

3 结论

建立了全血中4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone 5种4-取代卡西酮类结构类似物的UPLC-QTOF-MS检验方法,本文方法快速准确、回收率高,适用于区分全血中多种同位置不同取代基团的卡西酮类结构类似物的定性、定量分析,对于该类新型毒品的检测工作具有实际意义。