NaCl胁迫对不同抗性菜用大豆结瘤固氮的影响

孙继鑫，徐志伟，代重阳，孟 飞，王 聪

（1.内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽028043；2.呼和浩特市赛罕区蔬菜局，内蒙古 呼和浩特010000）

豆科植物和根瘤菌共生固氮所产生的生物固氮体系是自然界中最重要体系之一［1］，根瘤的共生固氮对豆科植物产量的提高和品质的提升起重要作用.同时，对减少氮肥用量、维持农业生产可持续发展以及提高作物品质也具有重要意义［2］.豆科植物和根瘤菌之间所产生的共生固氮作用会受到环境因子的限制，特别是逆境胁迫会对豆科植物根瘤的形成、发育以及根瘤的固氮效率产生影响，并对豆科植物和根瘤菌建立共生体系有重大影响［3］.李梅等［4］发现，当盐浓度升高至100 mmol·L-1时，根瘤数量和固氮区细胞数量会随着浓度的升高不断减少，且根瘤不断变小.Abdel等［5］表明，较低浓度的盐胁迫环境会对固氮酶活性和豆血红蛋白含量产生较多影响，而盐胁迫浓度较高的环境会对根瘤菌的质量和数量产生更大的影响，同时，豆科植物和根瘤菌良好的共生关系也会使植物的耐盐性得到提高.

菜用大豆是蔬菜食用大豆的总称，随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，近年来我国菜用大豆的栽培面积逐年增加，但中国的盐碱土总面积超过900 0万hm2，且受全球气候变暖、工业污染加剧和化肥施用不当等因素影响，土壤盐渍化不断加重，导致豆科植物的农业生产受到严重威胁［6-9］.因此，如何缓解盐胁迫伤害，在逆境下维持豆科植物较强的结瘤固氮能力，已成为当前迫切需要解决的问题.本研究以耐盐品种和盐敏感品种的菜用大豆与根瘤菌共生体为试材，研究NaCl胁迫对菜用大豆结瘤固氮的影响，以期为豆科植物抗盐机理的深入研究奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料 菜用大豆品种为盐敏感品种“日本青”和耐盐品种“绿领八号”（耐盐性为前期试验筛选）.“日本青”接种与其共生匹配性较好的快生型根瘤菌HH103，“绿领八号”接种与其共生匹配性较好的慢生根瘤菌USDA122，均购自黑龙江省农科院微生物研究所［10］.

1.2 试验方法

1.2.1 试材培育 挑选种皮较饱满的种子用95%乙醇冲洗，播种于口径10 cm、高10 cm的塑料钵中，采用蛭石作为基质，在每钵中播种2粒，定植1株，于人工气候箱中进行培育.

1.2.2 试验处理 试验设0（CK），50，75，100，125 mmol·L-15个NaCl浓度处理.待幼苗2片真叶完全展开后，在1/4 浓度无氮营养液中加入不同浓度的NaCl，在基质中均匀浇入；使用无菌水配置的水溶液施用于上述各处理，每处理10株，3次重复，完全随机排列.

1.2.3 菌悬液制备 通过活化、纯化后将根瘤菌接种到液体培养基中，在29 ℃、180 r·min-1振荡条件下黑暗培养，慢生菌种培养72 h，快生菌种培养48 h.

1.2.4 接种 NaCl处理后随即在幼苗的2片真叶完全展开后进行接种.将稀释后的根瘤菌悬浮液在幼苗根部周围用移液枪给每株接种1 mL.

1.3 指标测定 根瘤固氮酶活性的测定见参考文献［11］；豆血红蛋白含量的测定见参考文献［12］；根瘤类菌体NH3含量、根瘤细胞浆NH3含量见参考文献［13］；根系活力的测定见参考文献［14］.

1.4 数据分析 方差分析等使用Excel与SPSS软件进行分析并处理数据.

2 结果与分析

2.1 对生物量的影响 由表1可知，在不同浓度NaCl处理下，2个菜用大豆品种的地上部及地下部生物量均较对照显著降低，且降幅随NaCl 浓度的增大而增加，日本青地上部、地下部生物量在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl浓度下的降幅分别为16%，28%，36%，41%和28%，49%，51%，59%；绿领八号地上部、地下部生物量的降幅分别为13%，18%，37%，40%和22%，33%，47%，53%.除了在100 mmol·L-1NaCl浓度下绿领八号的地上部降幅高于日本青外，其余不同胁迫浓度下的降幅均低于日本青，同时，2个品种地下部生物量在不同浓度下的降幅均高于地上部.表明NaCl胁迫下2个品种地上部和地下部的生长均受到显著抑制，且受抑制程度随着胁迫浓度的增加呈逐渐增强趋势，而盐胁迫的危害对于根系更加严重.与日本青相比，NaCl胁迫对绿领八号根系及地上部生长的危害均相对较轻.

Tab. 1 Effects of NaCl stress on biomass of vegetable soybean表1 NaCl胁迫对菜用大豆生物量的影响

2.2 对根瘤形成、生长及固氮量的影响 由表2可知，在不同浓度NaCl处理下，日本青的根瘤数、根瘤鲜重、地上部植株含氮量、地下部植株含氮量均较对照显著降低，除了根瘤鲜重在125 mmol·L-1时和地下部植株含氮量在100 mmol·L-1时降低幅度随NaCl浓度的增大而减小外，其余浓度下降幅度均随NaCl浓度的增大而增加.在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl 处理下，根瘤数、根瘤鲜重较对照的降幅分别为21%，33%，46%，51%和21%，29%，41%，38%；地上部、地下部植株含氮量较对照的降幅分别为8%，10%，18%，21%和19%，30%，28%，35%.绿领八号在不同胁迫浓度下根瘤数、根瘤鲜重较对照的降幅分别为16%，30%，41%，47%和15%，25%，33%，35%；地上部、地下部植株含氮量较对照的降幅分别为7%，12%，17%，20%和14%，24%，21%，32%.绿领八号的根瘤数、根瘤鲜重及根系含氮量的降幅均低于日本青.表明NaCl胁迫下对2个品种根瘤形成、生长及固氮均产生了显著的抑制作用，且受抑制程度随着胁迫浓度的增大呈逐渐增强趋势.与日本青相比，绿领八号在NaCl胁迫下保持了相对较强的结瘤、固氮能力.

表2 NaCl胁迫对菜用大豆根瘤形成、生长及固氮量的影响Tab. 2 Effects of NaCl stress on root nodule formation，growth and amount of nitrogen fixation of vegetable soybean

2.3 对大豆根系活力的影响 由图1可知，在不同浓度NaCl处理下，2个品种的根系活力均较对照显著降低，且降幅随NaCl浓度的增大而增加，日本青根系活力在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl浓度下的降幅分别为17%，29%，66%，71%；绿领八号根系活力的降幅分别为17%，27%，54%，61%.除了在50 mmol·L-1NaCl浓度下绿领八号降幅与日本青相同外，其余不同胁迫浓度下的降幅均低于日本青.表明NaCl胁迫下2个品种的根系活力均受到显著抑制，且受抑制程度随着胁迫浓度的增加呈逐渐增强趋势，与日本青相比，绿领八号的根系活力在不同浓度NaCl胁迫下均保持相对较高活力.

2.4 对大豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性的影响 由表3可知，在不同浓度NaCl处理下，日本青的根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性均较对照显著降低，除了根瘤豆血红蛋白含量在125 mmol·L-1时降低幅度随NaCl浓度的增大而减小外，其余浓度下降幅均随NaCl浓度的增大而增加.在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl处理下，根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性较对照降幅分别为9%，19%，33%，28%和13%，26%，33%，34%.绿领八号在不同胁迫浓度下根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性均较对照降幅分别为7%，15%，26%，26%和9%，23%，30%，30%.绿领八号的根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性的降幅均低于日本青.表明NaCl胁迫下对2个品种固氮酶活性的提高以及根瘤豆血红蛋白的合成均产生了显著的抑制作用，且受抑制程度随着胁迫浓度的增大不断增强，但当浓度达到125 mmol·L-1时受抑制程度随着胁迫浓度的增大开始减弱.与日本青相比，绿领八号维持了相对较高的根瘤豆血红蛋白含量和较强的固氮酶活性.

2.5 对根瘤类菌体中氨含量和根瘤细胞浆中氨含量的影响 由表4可知，在不同浓度NaCl处理下，日本青根瘤类菌体中氨含量较对照显著降低，且降幅随NaCl浓度的增大而增加，在50，75，100，125 mmol·L-1NaCl处理下，其降幅分别为8%，13%，23%，27%；绿领八号在50 mmol·L-1NaCl浓度下的根瘤类菌体中氨含量未受显著影响，然而随着胁迫浓度升高，氨的形成受到显著抑制，氨含量在75，100，125 mmol·L-1NaCl降幅分别达11%，20%，21%.2个品种根瘤细胞浆中氨含量在50 mmol·L-1NaCl下均未受显著影响，其余浓度下均显著升高，日本青较对照的增幅分别为27%，28%，45%.绿领八号的增幅分别为22%，32%，40%.可见NaCl 胁迫对2 个品种根瘤中N2的还原及NH3的进一步转化均产生了显著的抑制作用，但较低浓度的NaCl对NH3转化的影响不显著.绿领八号与日本青相比，在NaCl胁迫下显示出较强的N2固定及转化能力.

图1 NaCl胁迫对菜用大豆根系活力的影响Fig. 1 Effects of NaCl stress on root activity of vegetable soybean

表3 NaCl胁迫对菜用大豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶的影响Tab. 3 The effects of NaCl stress on the hemoglobin content and nitrogenase activity of vegetable soybean root nodule leghemoglobin

表4 NaCl胁迫对菜用大豆根瘤类菌体和细胞浆中氨含量的影响Tab. 4 Effects of NaCl stress on ammonia content in root nodule bacteria and cytoplasm of vegetable soybean

3 讨论与结论

盐胁迫会使豆科植物根瘤的形成、发育及根瘤的固氮效率受到影响.王登科等［15］研究发现，盐胁迫对根瘤菌的生长起到抑制作用，最终使豆科植物的早期生长由于根瘤菌的抗氧化能力降低而受到限制.较低浓度的NaCl影响的是豆血红蛋白含量和根瘤固氮酶活性，而高浓度的NaCl会使大豆结瘤数和根瘤质量降低从而降低根瘤的固氮效率［16］.本研究中，2 个菜用大豆品种根瘤数、根瘤鲜重、固氮量在不同浓度NaCl胁迫下均显著下降，且受抑制程度随着盐胁迫浓度的增加而呈逐渐增强趋势，这与陈慧等［17］的研究结果不同.

根系活力是客观反映植物生理活性的重要指标，根系活力的强弱直接影响植物对土壤中矿物质元素和水分的吸收能力.NaCl 胁迫下菜用大豆根系发育受阻［18］，根系活力减弱，进而导致地上部生长受阻.根毛在信号识别、根瘤菌侵染过程中发挥着重要作用，而来自地上部的光合产物是根瘤生长发育的重要碳源和能源，因此，菜用大豆根瘤少而小的重要原因之一可能是因根系发育不良、根系活力减弱导致.

根瘤类菌体中的N2在固氮酶的作用下还原为NH3，并快速转移到细胞浆中，NH3通过谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰胺合成酶（GS）作用转化为氨基酸，当NH3迅速转化为氨基酸并且合成蛋白质时，固氮作用才能不断进行［19］.此外，豆血红蛋白对根瘤固氮酶活性需要低氧和高流量条件下才能发挥作用.豆血红蛋白可以维持豆科植物根瘤内较低O2，并可以给类菌体内的含铁血红蛋白有效地传递O2，且根瘤固氮酶活性也随其浓度的增大而增加［20-21］.本研究中，不同浓度NaCl胁迫下2个菜用大豆品种根瘤豆血红蛋白含量均显著降低，由于固氮酶活性的发挥对低氧高流量环境的需求随着根瘤豆血红蛋白含量的降低而无法保证，进而导致固氮酶活性受到抑制.不同浓度NaCl处理后，2个菜用大豆品种根瘤类菌体中氨含量显著降低，这与根瘤固氮酶活性降低是由根瘤豆血红蛋白含量降低所导致有关.同时，NaCl胁迫下根瘤细胞浆中NH3浓度显著增高，表明NaCl 处理造成NH3进一步转化障碍，而根瘤固氮酶活性也因细胞浆中NH3含量的积累产生反馈抑制.

本研究中，不同浓度NaCl处理下，耐盐品种“绿领八号”的结瘤数、瘤重及根部固氮量的降幅均低于盐敏感品种“日本青”，这与绿领八号在NaCl胁迫下能维持相对较高的豆血红蛋白含量、固氮酶活性，较强的根系活力以及较强的NH3转化能力密切相关.值得注意的是，NaCl胁迫下2品种菜用大豆地上部含氮量的降幅相近且均大幅低于地下部，表明NaCl胁迫下，菜用大豆将固定转化的氮素优先供给地上部，且2个品种氮素向地上部的转运能力相近.

根系活力、根瘤豆血红蛋白含量、固氮酶活性及NH3的进一步转化能力显著下降，是NaCl胁迫导致2个菜用大豆品种根瘤形成及发育受阻、固氮效率下降的重要因素.NaCl胁迫下，耐盐品种“绿领八号”具有相对较强的结瘤固氮能力，这与其能够维持相对较强的根系活力、根瘤豆血红蛋白含量、固氮酶活性及NH3的进一步转化能力密切相关.