γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch通路并纠正脑卒中后抑郁大鼠Th17/Treg失衡*

李 静， 尉 娜， 刘亚美， 苏 静， 宋景贵

（1新乡医学院第三附属医院神经内科，河南新乡453000；2新乡医学院第一附属医院神经内科，河南卫辉453100；3新乡医学院第二附属医院神经内科，河南新乡453002）

脑卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）是脑卒中中一种常见神经精神并发症[1]，目前发病机制尚未明确，可能包括生物学和心理学等多方面因素[2]。随着抑郁症细胞因子假说的提出，研究认为，抑郁可能与免疫学缺陷有关[3-4]。辅助性T 细胞（help T cell，Th）和调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）均是CD4+T 细胞不同亚群，Th17 细胞可特异性分泌细胞炎症因子，诱导炎症反应及自身免疫性疾病，而Treg 细胞具有免疫抑制作用，可维持自身免疫耐受，Th17/Treg比例失衡与抑郁症、卒中后疲劳等疾病密切相关[5-6]。Notch 信号通路不仅与细胞增殖分化凋亡有关，还具有免疫调节功能。研究证实，γ-分泌酶抑制剂DAPT｛N-[N-（3，5-difluorophenylacetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycinet-butyl ester｝是Notch 信 号通路有效阻断剂，在慢性丙型肝炎和过敏性哮喘等疾病中发挥调节Th17/Treg 平衡的作用[7-8]，但DAPT是否亦通过阻断Notch 信号通路调控Th17/Treg 平衡而参与PSD 尚未可知。因此，本研究拟通过建立PSD 大鼠模型，探究DAPT 调控Th17/Treg 平衡参与PSD 的作用机制，以期为阐明PSD 发生机制提供参考资料。

材料和方法

1 实验动物

健康清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠33只，7 周龄，体重220～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0007。大鼠于12 h/12 h 光照/黑暗、室温（22±2）℃环境中饲养，自由饮食、饮水。

2 药物和试剂

大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）线栓（型号：403556PK5Re）购自Doccol；DAPT（货号：D5942，HPLC≥98%）购自Sigma-Aldrich；RNA 提取试剂盒（货号：DP419）购自天根生化科技（北京）有限公司；实时荧光定量PCR（realtime quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（货号：D7268S）购自上海碧云天生物科技有限公司；白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：ab214028）、IL-10 ELISA 试剂盒（货号：ab214566）、兔源Ⅰ抗[anti-Notch1（货号：ab52627）、anti-Hes1（货号：ab108937）、anti-β-actin（货号：ab179467）、anti-CD4（货号：ab237722）和anti-Foxp3（货号：ab215206）]及Ⅱ抗羊抗兔IgG（货号：ab6721）均购自Abcam。

3 主要仪器

Model 550 型酶标仪购自Bio-Rad；7500 型RTqPCR 仪、Evolution 220 型紫外分光光度计、Forma Steri-Cycle i160 CO2培养箱购自Thermo Fisher；IX73荧光显微镜购自Olymplus；FACSCalibur 流式细胞仪购自Becton Dikinson。

4 方法

4.1 PSD 大鼠模型建立 根据敞箱实验（open-field test，OFT）及蔗糖偏爱实验（sucrose preference test，SPT）测定大鼠基线评分，筛选符合条件的33 只SD大鼠随机分成假手术（sham）组（n=10）和手术组（n=23）。手术组大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，参照文献[9]首先采用线栓法建立局灶性MCAO大鼠模型，术中插入栓线深度为（18±1）mm。术后24 h 参考文献[10]进行慢性不可预知性温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）刺激，大鼠在第1～15天分别进行禁食禁饮20 h、持续照明17 h、4℃强迫游泳5 min、45°倾斜笼17 h、禁饮17 h、湿笼21 h、水平震荡鼠笼5 min、夹尾1 min、行为约束2 h、禁食禁饮20 h、持续照明17 h、4℃强迫游泳5 min、45°倾斜笼17 h、禁饮17 h 处理、湿笼21 h；术中死亡3 只，成模大鼠20 只，成功率86.96%，随机分为PSD组和DAPT 组，每组各10 只。DAPT 组于MCAO 术后2 d 进行CUMS 刺激结合孤养，于第15 天皮下注射DAPT（5 mg/kg[11]），干预2 周；sham 组大鼠进行开颅手术但不阻断大脑中动脉，sham 组和PSD 组大鼠皮下注射等量生理盐水进行同等时间干预。模型成功标准：造模24 h 内出现明显神经功能缺陷；CUMS 刺激2 周后出现体重减轻、活动减少、蜷缩少动、兴趣感下降等抑郁样症状。

4.2 体重及行为学检测 各组大鼠于术前（0 d）及术后7、14、21 和28 d 分别进行体重检测、OFT 及SPT。（1）OFT：制备80 cm×80 cm×40 cm敞箱，壁周为黑色，底面用黑线划分为25 块面积相等的小块，记录5 min 内大鼠穿越底面方块数的水平运动评分，及以直立（两前肢离地超过1 cm）次数为评价指标的垂直运动评分；（2）SPT：参考曲淼等[3]的方法进行改进，给予1%蔗糖水饲养48 h，禁水4 h 后暴露于两个外观完全相同的瓶子（1 个盛满1%蔗糖水，另1 个盛满普通饮用水）1 h，测定大鼠糖水消耗体积与总消耗水体积比值。

4.3 海马Notch1 和Hes1 mRNA 表达水平检测 开颅取脑，分离海马组织，置于液氮中保存备用。提取各组5 只大鼠海马组织总RNA，反转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。采用RT-qPCR 扩增Notch1 和Hes1 mRNA 片段。20 μL 反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA（50 mg/L）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反应条件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40个循环。Notch1上游引物序列（5′→3′）为GCTGACCTGCGCATGTCTGCCATG，下 游 引 物 序 列（5′→3′）为CATGTTGTCCTGGATGTTGGCATCTG；Hes1 上游引物序列（5′→3′）为GCACAGAAAGTCATCAAAGCCTATT，下游引物序列（5′→3′）为GCTATCTTTCTTCAGAGCATCCAA；内参照GAPDH 上游引物序列（5′→3′）为GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT，下游引物序列（5′→3′）为TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC。采用2-ΔΔCt法定量分析Notch1 和Hes1 mRNA 相对表达水平。

4.4 海马Notch1 和Hes1 蛋白表达水平检测 采用Western blot 检测各组剩余5 只大鼠海马组织Notch1和Hes1 蛋白表达。蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 法测定蛋白质浓度，依次进行SDS-PAGE、转膜、封闭，分别添加Ⅰ抗[anti-Notch1（1∶2 000）、anti-Hes1（1∶1 000）和anti-β-actin（1∶2 000）]，4℃孵育过夜，添加Ⅰ抗IgG（1∶5 000）室温避光孵育1 h，增强化学法显影，蛋白条带灰度值用ImageJ软件分析。

4.5 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中Th17和Treg细胞比例检测 上述实验结束后将大鼠麻醉处死，采集4 mL 腹主动脉血于肝素钠采血管中抗凝，添加淋巴细胞分离液分离PBMC，RPMI-1640 培养基洗涤2 次后调整细胞密度为1×107/L。取100 mL，添加0.5 mL 佛波酯及0.5 mL 莫能菌素，混匀后于37℃、5% CO2培养箱中孵育4 h。细胞悬液混匀后转移至1.5 mL EP 管中添加0.5 mL CD4，4℃孵育30 min后，离心弃上清，PBS重悬细胞后分别添加PE-IL-17 抗体0.625 mL 和PEFoxp3 抗体5 mL，对照组分别加入同型PE-IgG2a 0.625 mL 和55 mL，4℃避光孵育30 min 后，上流式细胞仪分别检测Th17和Treg细胞比例。

4.6 血清IL-17 和IL-10 水平测定 外周血常规离心后分离血清，采用ELISA 检测各组大鼠血清IL-17和IL-10 水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

5 统计学处理

采用SPSS 25.0 软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 DAPT对PSD大鼠体重的影响

随着时间从延长，sham 组大鼠体重逐渐增加，而PSD组和DAPT组大鼠体重呈先降低后增加趋势；在0 d，各组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）；在7、14、21 和28 d，与sham 组比较，PSD 组大鼠体重均显著降低（P＜0.05）；在7 和14 d，PSD 组和DAPT组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）；在21和28 d，与PSD 组比较，DAPT 组大鼠体重显著增加（P＜0.05），见图1。

Figure 1. Effect of DAPT on the body weight of PSD rats. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图1 DAPT对PSD大鼠体重的影响

2 DAPT对PSD大鼠OFT结果的影响

各组大鼠0 d 基线水平运动评分和垂直运动评分差异无统计学意义（P＞0.05）；在7、14、21 和28 d，与sham 组比较，PSD 组大鼠水平运动评分和垂直运动评分均显著降低（P＜0.05）；在和14 d，PSD 组与DAPT 组大鼠水平运动评分和垂直运动评分差异无统计学意义（P＞0.05）；在21 和28 d，与PSD 组比较，DAPT 组大鼠水平运动评分和垂直运动评分显著升高（P＜0.05），见图2。

Figure 2. Effect of DAPT on the motor score of PSD rats in open-field test. A：horizontal motor score；B：vertical motor score. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图2 DAPT对PSD大鼠敞箱实验中运动评分的影响

3 DAPT对PSD大鼠糖水消耗比例的影响

各组大鼠0 d 糖水消耗比例差异无统计学意义（P＞0.05）；在7、14、21 和28 d，与sham 组比较，PSD组大鼠糖水消耗比例均显著降低（P＜0.05）；在7 和14 d，PSD 组与DAPT 组大鼠糖水消耗比例差异无统计学意义（P＞0.05）；在21 和28 d，与PSD 组比较，DAPT 组大鼠糖水消耗比例显著增加（P＜0.05），见图3。

4 DAPT 对PSD 大鼠海马组织Notch1 和Hes1 mRNA表达的影响

与sham 组比较，PSD 组大鼠海马组织Notch1 和Hes1 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）；与PSD 组比较，DAPT 组大鼠海马组织Notch1 和Hes1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），见图4。

Figure 3. Effect of DAPT on sugar water consumption ratio in PSD rats. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图3 DAPT对PSD大鼠糖水消耗比例的影响

Figure 4. Effect of DAPT on Notch1 and Hes1 mRNA expression in hippocampal tissues of PSD rats. Mean±SD.n=5. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图4 DAPT 对PSD 大鼠海马组织Notch1 和Hes1 mRNA 表达的影响

5 DAPT 对PSD 大鼠海马组织Notch1和Hes1蛋白表达的影响

与sham 组比较，PSD 组大鼠海马组织Notch1 和Hes1 蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）；与PSD 组比较，DAPT 组大鼠海马组织Notch1 和Hes1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见图5。

Figure 5. Effect of DAPT on Notch1 and Hes1 protein expression in hippocampal tissues of PSD rats. Mean±SD.n=5. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图5 DAPT 对PSD 大鼠海马组织Notch1 和Hes1 蛋白表达的影响

6 DAPT 对PSD 大鼠PBMC 中Th17 和Treg 细 胞比例的影响

与sham 组比较，PSD 组大鼠PBMC 中Th17 细胞比例和Th17/Treg 比值显著升高，Treg 细胞比例显著降低（P＜0.05）；与PSD 组比较，DAPT 组大鼠PBMC中Th17 细胞比例和Th17/Treg 比值显著降低，Treg细胞比例显著升高（P＜0.05），见图6。

7 DAPT 对PSD 大鼠血清IL-17 和IL-10 水平的影响

与sham 组比较，PSD 组大鼠血清IL-17 水平显著升高，IL-10 水平显著降低（P＜0.05）；与PSD 组比较，DAPT 组大鼠血清IL-17 水平显著降低，IL-10 水平显著升高（P＜0.05），见图7。

讨论

PSD 是卒中后脑部特定功能结构损伤，尤其是左侧额叶、颞叶、基底节、丘脑部位病变等，及各种心理和社会应激的共同作用结果[12]。研究显示，啮齿类动物在经历一系列CUMS 应激后可出现活动减少、兴趣下降、快感缺失等抑郁样行为[13]，因此本研究首先采用MCAO 术制备缺血性脑卒中SD 大鼠模型，再联合CUMS 及孤养法模拟卒中后负压力环境制备PSD 大鼠模型。结果显示，与sham 组比较，PSD 组大鼠随观察时间延长，体重呈先降低后缓慢增加趋势，可能与大鼠情感抑郁和食欲下降有关，也可能与应激过程禁食禁水等直接刺激有关，提示体重减轻可能直接反映应激对大鼠带来严重负面影响。而且OFT 中水平运动评分和垂直运动评分依次降低。OFT 是一种反映大鼠探索能力及情绪反应的经典实验，大鼠水平运动评分和垂直运动评分降低可反映大鼠存在兴趣下降、探索能力降低等抑郁症状。正常大鼠对甜味有偏好，而本研究结果显示PSD 组大鼠糖水消耗量比例降低，提示PSD 大鼠存在快感缺失症状，与Tao等[14]文献报道一致。综合以上结果提示，PSD模型制备成功，可用于后续实验。

Figure 6. Effect of DAPT on the proportions of Th17 and Treg cells in PBMC of PSD rats. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图6 DAPT对PSD大鼠PBMC中Th17和Treg细胞比例的影响

Figure 7. Effect of DAPT on serum IL-17 and IL-10 levels in PSD rats. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.图7 DAPT对PSD大鼠血清IL-17和IL-10水平的影响

DAPT 间接影响Notch 活化，进而影响细胞信号通路作用。Notch 通路是由一类在进化过程中高度保守的表面受体基因组成，可通过细胞间信号传递作用参与细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学过程。Notch 信号通路中Notch1 及其下游靶分子Hes1 表达上调不仅可促进巨噬细胞活化释放促炎因子，还可通过与不同配体结合调节Th17 细胞分化参与炎症反应[15-16]。Treg 及Th17 不仅在分化上存在联系，而且可相互转化，Th17 细胞主要分泌IL-17 和IL-6 等促炎细胞因子，Treg 细胞可分泌IL-10 和TGF-β 等，而Th17分化依赖TGF-β水平[17-18]。研究显示，Th17/Treg 细胞失衡 与Notch1 表 达 增加有 关[8]，而阻 断Notch 信号通路可通过抑制Treg 细胞功能，调节Th17/Treg细胞平衡，减轻大鼠肝纤维化[19]，还可通过抑制促炎因子释放改善动脉粥样硬化性缺血性脑卒中[11]。本研究结果显示，与sham 组比较，PSD 组大鼠海马组织Notch1 和Hes1 的mRNA 及蛋白水平，以及PBMC 中Th17 细胞比例和Th17/Treg 比值均显著升高，Treg 细胞比例降低，提示PSD 大鼠存在Th17/Treg 细胞平衡紊乱及Notch 信号通路激活。Notch 信号通路中配体与受体结合后经γ-分泌酶进行组成型酶切，激活相关基因表达，而DAPT 可抑制γ-分泌酶活性，间接阻断Notch 信号通路激活[20]。本研究亦采用DAPT 阻断Notch 信号通路，结果显示，与PSD 组比较，DAPT 组大鼠海马组织Notch1 和Hes1 的mRNA 及蛋白表达水平显著降低，PBMC 中Th17 细胞比例、Th17/Treg 比值及血清IL-17 水平降低，Treg细胞比例和血清IL-10 水平增加，大鼠体重、OFT 实验中水平运动评分、垂直运动评分及糖水消耗比例均显著增加，提示DAPT 阻断Notch 信号通路可能通过调控Th17/Treg 平衡减轻PSD 炎症反应，增强其自身免疫，从而减轻PSD大鼠抑郁样症状。

综上所述，DAPT 可减轻PSD 大鼠抑郁样症状，其机制可能是通过阻断Notch 信号通路进而缓解Th17/Treg失衡及炎症因子分泌。但本研究指标从大鼠行为上反映抑郁行为，主观性较强，使结果有一定偏倚，针对PSD 大鼠抑郁的更多客观性评价指标及具体作用机制有待深入探究。