基于12SrRNA和ND3基因序列分析巨遗传多样性及系统进化

杜 民，牛宝珍，雷美榕，普文华，彭跃颖，施来凤，周 甜，古金华

(1.湖南文理学院/生命与环境科学学院，水产高效健康生产湖南省协同创新中心，环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室，水生动物重要疫病分子免疫技术湖南省重点实验室，水产生物资源与环境生态湖南省工程研究中心，动物学湖南省高校重点实验室，常德市农业生物大分子研究中心，湖南常德 415000；2.红河学院,云南省高校农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室 云南蒙自 661199)

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 DNA提取、PCR扩增、克隆和测序

表1 巨12S rRNA基因和ND3基因PCR反应所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification of 12S rRNA and ND3 gene of B.yarrelli

表1 巨12S rRNA基因和ND3基因PCR反应所用引物Tab.1 Primers for PCR amplification of 12S rRNA and ND3 gene of B.yarrelli

目的基因引物引物序列(5′-3′)序列长度/bp文献12SrRNABaya16FBaya16RBaya17FBaya17RCACACATCHAAACAACAAGGHAGGTGTGGCRTAGCAAGGCGTCTTATACATGCAAGTATCCGCATAAGCTAGCTGTTTRGCTCAGG14001000[13]ND3Baya9FBaya9RTACAAGAAAACGTATAATGGCCCCGAAATCAGAGGTCTTRTRT1258[13]

1.3 数据分析

表2 10种科鱼类和登录号Tab.2 Accession number and information of the ten oridae fishes in Genbank

表2 10种科鱼类和登录号Tab.2 Accession number and information of the ten oridae fishes in Genbank

Sis类属GenBank登录号ND3基因长度/bp序列相似率/%12SrRNA基因长度/bp序列相似率/%巨(B.yarrlli)属(Bagarius)KT9834113468995496老挝纹胸(G.laosensis)纹胸属(Glyptothorax)KP2714383498495792中华纹胸(G.sinensis)纹胸属(Glyptothorax)KJ7396173498295891长丝黑(G.dolichonema)黑属(Gagata)JQ0262503498595892凿齿(G.andersonii)凿齿属(Glaridoglanis)JQ0262542958695791黑斑原(G.maculatum)原属(Glyptosternon)JQ0262513497995891黄斑褶(P.sulcata)褶属(Pseudecheneis)JQ0262593497895990藏(E.labiatum)属(Exostoma)JQ0262552798195587大鳍异齿(O.macropterus)异齿属(Oreoglanis)JQ02626131179扁头异(C.kamengensis)异属(Creteuchiloguis)JQ02625329586

2 结果与分析

取自3个河流5种群各12个个体样本的12S rRNA序列同红河河口群体12个个体比对得同源序列长度为954 bp，在这72个个体中发现有51个单倍型，其中取自怒江潞江坝河段的12个个体的序列中发现11个单倍型，澜沧江景洪群体中存在有10个单倍型，澜沧江临沧群体中发现有11个单倍型，红河曼耗群体中发现有7个单倍型，怒江三江口群体中共发现有9个单倍型，红河河口群体中发现有6个单倍型；在954个位点中共检测到246个保守位点，占25.8%，变异位点有708个，占74.2%，其中简约变异信息位点678个，单个变异位点30个(表3)；碱基的转换/颠换值为0.57(表3)；T、C、A、G碱基的平均含量分别为20.8%、25.7%、32.1%、21.4%，其中(A+T)含量52.9%高于(G+C)含量47.1%。

取自3个河流5种群各12个个体样本的ND3序列同红河河口群体12个个体的ND3序列经比对得同源序列长度为346 bp(澜沧江景洪群体、红河曼耗群体和红河河口群体)和349 bp(澜沧江临沧群体、怒江潞江坝群体和怒江三江口群体)，在这72条序列中发现有42个单倍型，其中取自怒江潞江坝河段12个个体的序列中发现7个单倍型，澜沧江景洪群体中存在有9个单倍型，澜沧江临沧群体中发现有10个单倍型，红河曼耗群体中发现有6个单倍型，怒江三江口群体中共发现有8个单倍型，红河河口群体中发现有5个单倍型；在349个位点中共检测到247个保守位点，占70.8%，变异位点有102个，占29.2%，其中简约变异信息位点77个，单个变异位点25个(表3)；碱基的转换/颠换值为5.4(表3)；T、C、A、G碱基的平均含量分别为29.5%、28.2%、28.1%、14.1%，其中(A+T)含量57.6%高于(G+C)含量42.3%。

表3 巨12S rRNA和ND3基因序列位点信息Tab.3 Sites information of 12S rRNA and ND3 gene sequence in B.yarrelli

表3 巨12S rRNA和ND3基因序列位点信息Tab.3 Sites information of 12S rRNA and ND3 gene sequence in B.yarrelli

基因保守位点变异位点简约信息位点单一位点比率(转换/颠换)12SrRNA246708678300.57ND324710277255.4

表4 巨线粒体ND3基因序列密码子及密码子使用频率Tab.4 Codon and its occurrence frequency of the mitochondrial ND3 gene in B.yarrelli

表4 巨线粒体ND3基因序列密码子及密码子使用频率Tab.4 Codon and its occurrence frequency of the mitochondrial ND3 gene in B.yarrelli

密码子计数密码子使用频率密码子计数密码子使用频率密码子计数密码子使用频率UUU(F)3.81.47UCU(S)3.11.39UAC(Y)1.21.52UUC(F)1.40.53UCC(S)1.70.77UAA(∗)10.71UUA(L)3.21.63UCA(S)4.62.06UAG(∗)00UUG(L)00.01UCG(S)0.10.04CAU(H)1.30.95CUU(L)0.90.43CCU(P)5.92.13CAC(H)1.51.05CUC(L)4.42.22CCC(P)2.91.05CAA(Q)12CUA(L)21.03CCA(P)2.30.82CAG(Q)00CUG(L)1.40.68CCG(P)00AAU(N)2.80.99AUU(I)61.58ACU(T)6.32.18AAC(N)2.81.01AUC(I)1.90.5ACC(T)3.11.07AAA(K)1.11.97AUA(I)3.40.91ACA(T)2.20.75AAG(K)00.03AUG(M)4.41ACG(T)00GAU(D)1.11.15GUU(V)0.10.17GCU(A)1.20.97GAC(D)0.80.85GUC(V)0.91.63GCC(A)2.31.93GAA(E)1.61.58GUA(V)0.71.27GCA(A)1.31.1GAG(E)0.40.42GUG(V)0.50.93GCG(A)00AGG(R)42UGU(C)1.50.9CGA(R)2.31.16GGU(G)11.6UGC(C)1.81.1CGG(R)00GGC(G)0.50.81UGA(∗)3.32.29AGU(S)1.20.52GGA(G)11.55UGG(W)01AGC(S)2.71.22GGG(G)00.04CGU(R)10.51AGA(R)2.91.47CGC(R)1.70.86UAU(Y)0.40.48

表5 巨线粒体12S rRNA和ND3基因的遗传多样性及中性检测Tab.5 Genetic diversity and neutral test of mitochondrial 12S rRNA and ND3 genes in B.yarrelli

表5 巨线粒体12S rRNA和ND3基因的遗传多样性及中性检测Tab.5 Genetic diversity and neutral test of mitochondrial 12S rRNA and ND3 genes in B.yarrelli

基因种群样本数单倍型数单倍型占比/%HdPiKTajima′sDFu′sFs12SrRNABaya-B121191.70.9850.0146313.93939-1.07983-1.912Baya-J121083.30.9550.0271525.848481.104020.772Baya-L121191.70.9850.0182417.37879-0.12932-1.364Baya-M12758.30.7730.002242.13636-1.94237-2.351Baya-N12975.00.9090.008888.43939-2.20100-0.739Baya-H12650.00.8640.002132.10606-1.19064-2.396总数725170.80.9720.0346331.41354-0.32355-7.502ND3Baya-B12758.30.8330.0306510.66667-0.886812.040Baya-J12975.00.9090.0574519.878791.958971.369Baya-L121083.30.9700.0122117.969700.82255-0.029Baya-M12650.00.6820.003851.33333-1.98343-2.456Baya-N12866.70.8480.018676.51515-2.05689-0.355Baya-H12541.70.5760.002891.00000-1.89423-1.899总数724258.30.9370.0787727.175670.74982-2.676

根据Mega5.02中的Kimura2-Parameter 计算得到的遗传距离(见表6)可以看出，通过12S rRNA基因序列检测到的51个单倍型的平均遗传距离(转换+颠换)为0.520，通过ND3基因序列检测到42个单倍型平均遗传距离为1.743(ND3>12S rRNA)，基于12S rRNA基因的51个单倍型所得到的转换/颠换的平均值为0.57，基于ND3基因的42个单倍型所得到的转换/颠换的平均值为5.4(ND3>12S rRNA)，其中12S rRNA基因序列检测到的距离的最大值出现在澜沧江景洪群体和澜沧江临沧群体间(1.062)，最小值出现在红河曼耗群体和红河河口群体间(0.004)；ND3基因中的最大值分别出现在怒江三江口群体和澜沧江景洪群体(0.143)，同样的其最小值也出现在了红河曼耗群体和红河河口群体间(0.008)，表明澜沧江景洪群体与怒江三江口群体关系较远，而红河曼耗群体与红河河口群体关系较近。

表6 巨种群间的遗传距离Tab.6 Genetic distance between populations of B.yarrelli

表6 巨种群间的遗传距离Tab.6 Genetic distance between populations of B.yarrelli

基因种群Baya-BBaya-JBaya-LBaya-MBaya-NBaya-H12SrRNABaya-B0.6620.9223.4144.1803.433Baya-J0.5950.5360.5930.6770.600Baya-L0.9131.0620.5640.5310.568Baya-M0.1580.5051.0414.074n/cBaya-N0.1220.5361.0190.0474.074Baya-H0.1580.5081.0430.0040.047ND3Baya-B6.3447.5906.8679.0156.449Baya-J0.1416.5786.4426.6915.998Baya-L0.0860.1305.6578.6875.254Baya-M0.1260.0780.1126.9491.340Baya-N0.0400.1430.0950.1296.544Baya-H0.1240.0800.1100.0080.128

注：正三角为转换+颠换，倒三角为R=Si/Vi。

表7 巨种群内的遗传距离Tab.7 Genetic distance in the population of B.yarrelli

表7 巨种群内的遗传距离Tab.7 Genetic distance in the population of B.yarrelli

基因转换/颠换Baya-BBaya-JBaya-MBaya-NBaya-LBaya-H转换+颠换Baya-BBaya-JBaya-MBaya-NBaya-LBaya-H12SrRNA2.5981.104n/c7.4807.035n/c0.2330.2840.0040.0120.0200.003ND37.4604.481n/c14.217.0291.6750.0510.0590.0080.0370.0510.009

2.4 巨线粒体12S rRNA和ND3基因系统发育关系分析

本实验利用3河流6种群51个单倍型的12S rRNA基因序列同科7属8种鱼类(见表2)进行系统发育树的构建，构建后的结果见图1(左)，可看出属与黑属、纹胸属汇聚成一大单系群，其中巨又可独自汇成一支，支持率达到99%，据其类群的不同，又可分为两大系群，一支即由怒江潞江坝群体、怒江三江口群体及澜沧江临沧群体所汇聚而成；另一支则由澜沧江景洪群体、红河曼耗和红河河口群体所构成，其中澜沧江景洪群体能构成一个单系种群，其支持率分别达到99%和99%，而褶属、属、凿齿属及原属则构成另一单系群。同样的将42个单倍型的ND3基因序列与科9属10种鱼类(见表2)进行系统发育树的构建，其结果见图1(右)，可看出属与异齿属聚集成一支，其中巨也可独自汇成一支，支持率为91%，同12S rRNA构建的系统树相同，怒江潞江坝群体、怒江三江口群体及澜沧江临沧群体还是同样地汇聚成一支，澜沧江景洪群体能构成单系种群，支持率为100%和100%，而褶属、属、凿齿属、原属、黑属、纹胸属及异属则汇成另一支。

图1 科7属8种鱼类及51个单倍型的12S rRNA基因序列NJ系统进化树(左)和科9属10种鱼类及42个单倍型的ND3基因序列NJ系统进化树(右)Fig.1 NJ phylogenetic tree(left) of 8 sisoridae species from 7 genera based on 51 haplotypes of 12S rRNA gene sequence and NJ phylogenetic tree(right) of 10 sisoridae species from 9 genera based on 42 haplotypes of ND3 gene sequence

3 讨论

3.1 巨线粒体12S rRNA及ND3基因的结构特征

3.2 巨线粒体12S rRNA及ND3基因的遗传多样性

3.3 巨线粒体12S rRNA及ND3基因的遗传距离

3.4 巨线粒体12S rRNA及ND3基因的系统发育树