膝关节骨性关节炎患者关节镜术后血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平变化及临床意义

白云鹤

（焦作市人民医院关节外科，河南 焦作 454002）

膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的慢性退行性骨关节病，初期一般表现为关节痛、酸胀和不适，随着病情进展，可出现关节积液、关节交锁、O型腿或X型腿等[1-2]。关节镜手术目前临床常用的治疗KOA的术式之一，可以利用关节器械通过小切口进入到关节腔，可以缩短手术切口，适用范围广，且术后疤痕挛缩不会影响关节活动，关节内部结构清晰可见，不遗漏[3]。微小核糖核酸-140 (microRNA-140,miR-140)是一种的非编码小分子RNA，广泛参与细胞的增殖、分化和凋亡。既往研究显示，miR-140在冠心病及肺癌中出现异常表达[4-5]。然而miR-140在KOA患者中的表达情况尚未见相关文献记载。 白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）是一种促炎细胞因子,能激活中性粒细胞和巨噬细胞吞噬入侵的病原体，释放有毒的氧和氮自由基，参与抗病毒和抗感染的免疫过程[6]。基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)是基质金属蛋白酶家族成员之一,在骨关节炎发展过程中起重要作用[7]。因此，本研究在采用节镜手术治疗KOA患者的基础上，观察关节镜手术后KOA患者血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平的变化，并分析该指标的变化与KOA患者疗效的相关性，为术后治疗方案调整提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年2月至2021年2月在本院收治的KOA患者120例，其中男性79例，女性41例，年龄47～73岁，平均（60.57±6.56）岁。纳入标准：符合KOA诊断标准[8]；患者及家属了解并给予知情同意。排除标准：⑴类风湿性关节炎；⑵化脓性关节炎；⑶痛风性关节炎；⑷免疫性关节炎；⑸关节外伤；⑹严重躯体疾病。所有患者均采用关节镜手术治疗，根据术后1个月疗效将其分为优良组（n=88）和中差组（n=32）。经医院伦理委员会通过。

1.2 治疗方法 所有患者均采用关节镜手术治疗。首先实施硬膜外麻醉，患者仰卧在手术台上。大腿根部安装下肢止血带。准备好灌洗液并保持适当的压力。碘伏常规消毒皮肤，铺无菌巾。在膝部做外侧或内侧小切口1 cm至关节腔，屈膝90°置入关节镜。通过关节镜探查关节腔，然后去除游离体、骨刺和病变半月板。采用负压吸引装置彻底吸除关节腔内的残留的组织碎片。术后彻底冲洗关节腔，取出器械并放置引流管。

1.3 疗效评估 术后1个月后进行临床疗效评估[9]。优：膝关节疼痛、肿胀及僵硬等临床症状完全消失，功能基本恢复，可正常行走。良：膝关节疼痛基本消失，肿胀及僵硬等临床症状明显减轻，功能基本恢复，疲劳时可复发。中：膝关节疼痛、肿胀及僵硬等临床症较前略有减轻，疲劳时可反复发作。差：膝关节相关临床症状和体征无改善，活动仍受限。

1.4 观察指标

1.4.1 一般资料 根据研究目的，设计调查表，收集所有患者的一般资料，包括性别、年龄、病程、体质指数（body mass index,BMI）、病变部位、半月板破裂情况、KOA遗传史、吸烟史、饮酒史、术后康复锻炼情况、是否合并糖尿病及高血压。

1.4.2 膝关节关节活动度 采用疼痛视觉模拟评分(Visual Analogue Scale/Score,VAS)[10]评估术前和术后1个月的疼痛程度。方法是使用一条长约10cm的游动标尺，一面标有10个刻度，两端分别为“0”分端和“10”分端，0分表示无痛，10分表示最剧烈的无法忍受的疼痛。采用奎森功能演算指数(Lequesne)[11]评分来评价术前及术后1个月的病情及关节功能。量表分为疼痛或不适5项（0～8分）、行走能力（0～8分），生活能力（0～8分）3个部分。得分越高，说明膝骨性关节炎越严重。采用膝关节关节活动度(range of motion,ROM)[12]来评价术前和术后1个月的膝关节活动度。用膝关节量角器测量膝关节ROM，以股骨外髁为轴，以股骨纵轴为固定臂，以腓骨小头与外踝的连线为移动臂，测量膝关节屈伸范围，设定膝关节伸直时活动度为0°。

1.4.3 血清学指标 分别于术前、术后1个月清晨抽取空腹静脉血3 ml，室温下放置2 h，然后1000×g离心20 min，取上清待检。采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）法测定血清miR-140表达水平。按照上海科敏生物科技有限公司生产的miR-140试剂盒中的操作步骤，提取血清总RNA。选用上海研卉生物科技有限公司提供的逆转录试剂盒，将血清总RNA逆转录为cDNA。以U6作为内参基因（上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。miR-140引物（上游引物：：5′-ACACTCCAGCTGGGTAC CACAGGGTAG-3′；下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′）。引物由赫澎（上海）生物科技有限公司提供。反应条件：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，灭活逆转录酶活性，用去离子水将cDNA稀释10倍后-20℃保存。采用上海艾研生物科技有限公司生产的ABI实时荧光定量PCR仪QuantStudio 3进行qRT-PCR操作。程序设定为：95℃预热3 min，(95℃30 s，60℃30 s，72℃15 s)35个循环，72℃5 min终止反应。采用2-ΔΔCt算法计算miR-140相对表达水平。采用酶联免疫吸附法测定检测IL-1β水平，试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司。按照试剂盒操作说明，每孔加标准品或样品100μl。除去液体。加入100μl生物素化检测抗体，37℃孵育1 h。除去液体。加入100μl辣根过氧化物酶偶联物。37℃孵育30 min。吸出并冲洗5次。加入90μl底物试剂。37℃孵育15 min。加入50μl停止液。立即在450 nm处读取光密度值。计算IL-1β浓度。同法检测MMP-13水平。试剂盒购自南京卡米洛生物工程有限公司。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，满足正态分布且方差齐的计量资料采用（±s）表示，采用两样本独立t检验比较组间差异，计数资料用率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KOA患者关节镜术后的临床疗效 120例KOA患者术后1个月，优52例，良36例，中30例，差2例。优良率为73.33%（88/120）、中差率为26.67%（32/120）。

2.2 两组KOA患者一般资料比较 优良组患者在年龄、病程、BMI、半月板破裂、吸烟史、术后康复锻炼及合并糖尿病方面与中差组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组KOA患者一般资料比较（n，%）

2.3 两组KOA患者的VAS评分、SAS评分与Lequesne指数比较 术后1个月，优良组KOA患者的VAS评分与Lequesne指数评分均低于中差组（P＜0.05），优良组KOA患者的ROM大于中差组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组KOA患者的VAS评分与SAS评分比较（±s）

表2 两组KOA患者的VAS评分与SAS评分比较（±s）

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2.4 两组KOA患者的血清学指标比较 术后1个月，优良组KOA患者的miR-140表达水平高于中差组（P＜0.05），优良组KOA患者的IL-1β、MMP-13水平均低于中差组（P＜0.05）。见表3。

表3 两组KOA患者的血清学指标比较（±s）

表3 两组KOA患者的血清学指标比较（±s）

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2.5 血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平变化与ROM之间的相关性分析 Spearson相关性分析显示，血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平变化与ROM呈显著的正相关关系（r=0.342，P＜0.05）。

2.6 血清miR-140表达与IL-1β、MMP-13之间的相关性分析Spearson相关性分析显示，血清miR-140表达与IL-1β、MMP-13呈显著的正相关关系（r=0.331，P＜0.05）。

2.7 血清miR-140、IL-1β、MMP-13对KOA患者疗效的预测价值 将两组纳入ROC曲线分析，血清miR-140、IL-1β、MMP-13及 联 合 检 测 预 测KOA患者疗效的曲线下面积(areas under the curve,AUC)分别为0.745、0.712、0.660、0.903（P＜0.05）。见图1、表4。

图1 血清miR-140、IL-1β、MMP-13与KOA患者疗效的ROC曲线测量值

表4 血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平与KOA患者疗效的ROC曲线特征

3 讨论

KOA是一种以关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节疾病[13]。临床上以中老年患者最为常见，女性发病率(70%)高于男性[14]。典型的症状是膝关节疼痛和肿胀，随着时间的推移会逐渐发展，并可能导致膝关节畸形[15]。KOA的发生对患者的日常生活有严重的影响，尤其是行走和上下楼梯时会更加痛苦。因此，要及早发现，及时治疗，避免出现关节畸形等情况。

本研通过关节镜手术的方式来治疗KOA患者，结果显示，120例KOA患者术后1个月，关节功能恢复的优良率为73.33%，说明关节镜手术对KOA患者有较好的疗效。关节镜手术是关节疾病中常用的一种微创技术，通过自然关节间隙，打开两个直径5 mm左右的通道，在关节内置入棒状光学仪器，然后在显示器上反映关节的细微结构，在关节镜的监视下取出关节病变滑膜、游离体及其他病理物质，具有创伤小，术后愈合效果好等优点[16]。本研究结果显示，优良组KOA患者在年龄、病程、BMI、半月板破裂、吸烟史、术后康复锻炼及合并糖尿病方面与中差组相比，差异显著，提示以上因素可能是影响KOA患者疗效的危险因素。本研究结果显示，术后1个月，优良组KOA患者的VAS评分与Lequesne指数评分均低于中差组，提示关节镜手术可以减轻患者的疼痛，改善患者的关节功能。既往实践证明，关节镜下关节成形术能够显著缓解KOA患者的临床症状，并能有效减轻膝关节疼痛，有较好的治疗效果[17]。因关节镜手术是一种创伤小、安全有效、疼痛少、易于被患者接受的微创治疗方法，且术后早期即可活动和使用肢体，关节功能恢复快，可有效缓解患者的症状。同时本研究结果显示，优良组KOA患者的ROM大于中差组，提示关节镜手术可改善患者的关节活动范围。由于关节镜手术早期患者即可活动肢体，关节功能恢复较快，因而关节活动范围大于中差组。

本研究结果显示，术后1个月，优良组KOA患者miR-140的表达水平高于中差组。miR-140在软骨细胞中呈特异性高表达，在维持软骨细胞平衡的同时，调节人类软骨形成和发育[18]。既往研究显示，miR-140参与骨关节炎软骨的损伤修复[19]。结合本研究结果说明，miR-140高表达有利于KOA患者的软骨修复。本研究结果显示，优良组KOA患者术后1个月的IL-1β、MMP-13水平均低于中差组，提示关节镜手术可减轻KOA患者的炎症反应。IL-1β由先天免疫系统的前哨细胞，即单核细胞和巨噬细胞产生，对免疫应答的组织修复中显示出较大优势。当机体受到致病菌、病毒及其类似物刺激时，IL-1β分子可迅速激活，以不同形式参与抗病毒和抗感染的免疫过程[20]。IL-1β水平可反映机体炎症疾病的严重程度，提示关节镜手术可有效降低机体的炎症反应。在骨和软骨的发育过程中，MMP-13参与了关节炎中关节损伤和破坏的过程。MMP-13水平的降低有利于KOA患者关节损伤的修复。Spearson相关性分析显示，血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平变化与ROM呈显著的正相关关系，提示血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平的变化会直接影响KOA患者的术后康复。ROC曲线分析结果显示，血清miR-140、IL-1β、MMP-13及联合检测预测KOA患者疗效的AUC分别为0.745、0.712、0.660、0.903，提示临床可根 据 血 清miR-140、IL-1β、MMP-13水 平 预 测KOA患者疗效。

综上所述，关节镜手术治疗KOA患者，可减轻患者的疼痛、焦虑，提高血清miR-140表达水平，降低血清IL-1β、MMP-13水平，改善关节活动度。血清miR-140、IL-1β、MMP-13水平对KOA患者疗效有较高的预测价值。