EV71型HFMD患儿血清25-（OH）D水平与其细胞免疫功能的相关性

陈梅，陈芳，宋春兰

（郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院 郑州市儿童急危重症医学重点实验室，河南 郑州 450000）

手足口病（HFMD）是因肠道病毒感染引起的儿科常见急性传染病，其致病原以肠道病毒71型（EV71）和肠道病毒CA16型较为多见，5岁以下儿童易感[1]。既往研究表明EV71型HFMD在近年来丙类传染病中致死率占第一位[2]。一般普通型HFMD预后良好，而重症患儿病死率高、预后差，目前临床尚未明确该病的致病机制以及致死原因，因此早期预测EV71型HFMD重症化风险，并及时给予干预十分必要。血清25-羟维生素D[25-（OH）D]是反映机体维生素D（VD）营养状况的最佳指标，既往常用于评估儿童骨骼生长发育情况[3]，但近年来多项研究发现心血管系统、代谢综合征等多种疾病的发生均与VD缺乏密切相关[4-5]。随着临床对于VD的进一步研究，发现血清25-（OH）D水平与儿童多种感染性疾病存在一定的相关性，并认为通过影响机体免疫功能和炎症反应程度促使其对病毒易感性增加[6]。淋巴细胞是反应机体免疫功能的重要免疫细胞群，包括T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）；而基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18均是反映细胞炎症反应的重要指标。Zhou JF[7]等人研究发现EV71型感染HFMD患儿体内T淋巴细胞亚群以及NK细胞比例随病情加重呈逐步减少趋势。但目前仍缺乏关于EV71型HFMD患儿VD缺乏与免疫功能关系的系统分析，基于此，本研究通过探讨血清25-（OH）D水平与其细胞免疫功能的相关性，以进一步证实两者间的关联性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2019年2月至2021年2月诊治的78例EV71型HFMD患儿作为研究组。纳入标准：⑴符合HFMD诊断标准[8]；⑵外周血EV71-IgM和咽拭子或肛拭子EV71核酸检测均为阳性；⑶病程低于5 d；⑷患儿临床资料完整。排除标准：⑴合并血液系统、免疫系统等严重基础疾病者；⑵合并其他出疹性疾病；⑶近3个月内注射过大剂量VD制剂；⑷近期存在免疫抑制剂或免疫增强剂使用史。另选择同期健康儿童85例作为对照组。研究组男41例，女37例；年龄1～8岁，平均（3.27±1.16）岁；疾病严重程度：普通型53例，重症型25例。对照组男例，女例；年龄1～9岁，平均（3.52±1.39）岁。两组研究对象一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法 研究组患儿于入院次日清晨采集空腹静脉血2 ml+2 ml[2 ml用于检测血清25-（OH）D水平，另2 ml用于检测免疫功能]，对照组儿童于体检当日采集。采用化学发光法检测血清25-（OH）D水平，仪器为自动化免疫分析仪，试剂盒由山东英盛生物技术有限公司提供。具体操作步骤如下：将样本室温下静置30 min，以3000 r/min的速度离心10 min，取上清液，采用自动化免疫分析仪自动检测，并记录结果。采用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞亚群水平，具体方法：将50μl混匀全血标本与带有荧光标记的单克隆抗体10μl置于试管，室温避光孵育20 min，加入溶血素250 μl，混匀，1800 r/min离心5 min，弃去上清液，加磷酸盐缓冲液250μl，混匀，采用流式细胞仪检测。采用酶联免疫吸附法检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18水平，试剂盒由厦门慧嘉生物科技有限公司提供。

1.3 统计学方法 SPSS20.0统计软件分析数据，均经过正态分析及方差齐性检验，计量资料以表示，行t检验；采用Pearson相关性分析血清25-（OH）D与免疫功能指标相关性；采用受试者工作特征曲线（ROC）分析血清25-（OH）D与免疫功能指标对于EV71型HFMD患儿重症化风险预测价值；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清25-（OH）D水平以及免疫功能比较研究组患儿血清25-（OH）D、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均显著低于对照组，NK、MMP-9、IL-1β和IL-18水平显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组血清25-（OH）D水平以及免疫功能比较（±s）

表1 两组血清25-（OH）D水平以及免疫功能比较（±s）

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2.2 不同疾病严重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比较 重症型患儿血清25-（OH）D、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均显著低于轻症型，NK、MMP-9、IL-1β和IL-18水平显著高于轻症型（P＜0.05）。见表2。

表2 不同疾病严重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比较（±s）

表2 不同疾病严重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比较（±s）

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2.3 血清25-（OH）D与免疫功能指标相关性 血清25-（OH）D与CD4+、CD8+呈正相关，与NK呈负相关（P＜0.05），与CD4+/CD8+之间无显著相关性（P＞0.05）。见表3、图1-6。

图1 血清25-（OH）D与CD4+相关性

表3 血清25-（OH）D与免疫功能指标相关性

2.4 血清25-（OH）D与细胞免疫功能指标对于EV71型HFMD患儿重症化风险预测价值 血清25-（OH）D与CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK、MMP-9、IL-1β、IL-18均对EV71型HFMD患儿重症化风险具有较好的预测价值，其截断值分别为≤37.74 ng/ml、≤26.49%、≤18.41%、≤1.14、＞26.26%、＞95.78 ug/L、＞43.72 ng/L、＞66.25 ng/L，其中以IL-1β、IL-18的AUC值最高（P＜0.05）。见表4、图7。

表4 血清25-（OH）D与免疫功能指标对于EV71型HFMD患儿重症化风险预测价值

图7 EV71型HFMD患儿重症化风险预测曲线

3 讨论

HFMD好发于夏秋季节，近年来，我国HFMD发病率和死亡率均呈现明显上升趋势，已成为威胁儿童健康的严重卫生问题，也为家庭以及社会带来了巨大的经济负担。目前已有研究表明，异常的免疫炎性反应促使EV71型感染HFMD病情进展[9]，但EV71感染后的宿主获得性免疫反应，尤其是T淋巴细胞的变化，目前尚不明了。25-（OH）D水平缺乏或不足已被发现在抗感染、正常免疫功能的维持等方面具有重要意义，国内部分学者发现血清25-（OH）D缺乏与感染性疾病患儿免疫功能降低密切相关[10]，但对于EV71型感染的HFMD患儿尚缺乏研究。

图2 血清25-（OH）D与C84+相关性

图3 血清25-（OH）D与NK相关性

图4 血清25-（OH）D于MMP-9相关性

图5 血清25-（OH）D与IL-1β相关性

图6 血清25-（OH）D与IL-18相关性

VD不仅可促进儿童生长发育，还是一种免疫调节剂，具有调节免疫细胞的生长以及分化的作用。目前多位研究者发现25-（OH）D的缺乏是一些感染相关性疾病的危险因素，甚至与脓毒症等危重症患儿死亡密切相关，增加了疾病的严重程度[11]。EV71型HMFD发病人群以5岁一下婴幼儿为主，与VD缺乏好发年龄段相似。Ke Y[12]等人研究发现EV71型HFMD发病与感染后固有免疫以及适应性免疫功能紊乱相关，而VD的抗感染作用也是通过固有免疫以及适应性免疫的调节作用发挥。本研究结果显示研究组、重症型患儿血清25-（OH）D水平显著低于对照组、普通型，提示EV71型HFMD的发生、发展与VD缺乏密切相关。分析其原因可能为，VD受体可在活化的T细胞上表达，当VD缺乏或不足时，表达VD受体的T细胞减少，进而导致机体免疫功能降低，抗病毒能力降低，促使疾病发生发展[13]；EV71型HFMD的发生会导致神经系统和心肺功能受损，VD缺乏或不足会导致能表达VD受体的组织受到抑制，而VD受体基因缺乏后会导致机体对感染性疾病以及自身免疫性疾病的易感性增加。Fisher SA[14]等人研究表明儿童检测血清25-（OH）D水平缺乏或不足时，其患HFMD的概率大幅度增加，也证明了本研究观点。

机体炎症反应的过度激活以及抗病毒免疫防御功能在病毒感染性疾病的发生、发展过程中具有重要作用。EV71型HFMD患儿固有免疫呈紊乱状态，因EV71入侵后在NK细胞、树突状细胞上大量复制，同时其入侵可激活固有免疫细胞，诱导适应性免疫抵抗病原。有学者对HFMD患儿的淋巴细胞亚群分析，发现其细胞免疫、体液免疫功能均下降[15]。国外也有研究发现EV71型HFMD感染后，细胞免疫因子出现低水平甚至抑制状态，并认为细胞免疫在该病的重症化中起着重要作用[16]。本研究中，研究组、重症型患儿CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均显著低于对照组、普通型，NK、MMP-9、IL-1β、IL-18水平显著高于对照组、普通型，也提示EV71型HFMD患儿存在免疫功能抑制以及炎症反应过度激活状态，且与该病重症化关系密切，进一步证实了既往研究结果。在此基础上，本研究进一步对VD与免疫功能、炎症反应的关系进行分析，结果显示血清25-（OH）D与CD4+、CD8+呈正相关，与NK、MMP-9、IL-1β、IL-18呈负相关，与CD4+/CD8+之间无显著相关性，提示血清25-（OH）D水平降低可影响EV71型HFMD患儿细胞免疫功能和炎症反应。究其原因，EV71入侵宿主后会降低免疫细胞活性，导致T淋巴细胞亚群降低，同时VD可调控机体的免疫应答，大量的VD消耗，导致血清25-（OH）D水平降低；血清25-（OH）D水平降低可反映宿主防御、炎症反应等功能降低，难以全面抵抗病原菌，从而导致增加婴幼儿易感性以及病情程度严重性[17]；VD可促进白细胞激素的产生，促使活化CD4+、CD8+T淋巴细胞，使其与VD受体结合，故血清25-（OH）D降低可导致T淋巴细胞活化受到抑制，降低患儿免疫系统的保护作用。此外，EV71侵入机体可激活体内的炎症反应，促使炎症细胞因子的过度释放并损伤全身多处器官组织，最终增加HFMD的重症化风险。既往有学者研究也表明危重症HFMA患儿存在MMP-9等炎症因子水平明显升高现象[18]，与本研究结果相一致。本研究通过ROC曲线分析，也发现血清25-（OH）D、T淋巴细胞亚群以及、MMP-9、IL-1β、IL-18均可较好的预测EV71型HFMD患儿重症化风险，为临床及时干预治疗可提供一定的参考。但本研究仍存在不足之处，因近年来本院HFMD的救治技术较前明显提高，危重症以及死亡患儿较少无法进行分组，故将其合并于重症组内，后续将继续研究；同时血清25-（OH）D以及免疫功能指标的临界值仍需要通过前瞻性研究验证其可靠性，以探索其对于EV71型HFMD发生发展的预警价值。

综上所述，EV71型HFMD血清25-（OH）D水平与免疫功能呈正性相关，与炎症细胞因子呈负相关，三者均与疾病重症化相关，且可作为该病重症化的预警因素。监测血清25-（OH）D、免疫功能指标以及炎症细胞因子水平对评估EV71型HFMD患儿严重程度、提高干预具有重要意义。