维生素在皮肤抗光老化方面的研究进展

庄 洁 陈晗俊 吴 旭

（华熙生物科技股份有限公司上海研发中心，上海，200131）

“抗衰老”是人们追求的永恒目标，也是科学研究者们的研究热点。皮肤是人体最大的器官，其衰老最显而易见，例如出现皱纹、干燥、松弛等现象。现有的研究发现，皮肤衰老包括两个同时进行的独立过程：（i）固有的老化，即按时间发展的自然老化，以及（ii）外在老化或光老化，这是由于其暴露于紫外线（UV）在内的环境因素导致的。自然老化的皮肤会变薄、干燥，并出现细皱纹[1]。而光老化导致的临床上明显的皮肤改变，以深皱纹、粗糙、松弛、斑点状色素沉着、毛细血管扩张和各种良性和恶性肿瘤为特征[2]。

在生理上，光老化主要取决于阳光的照射程度和皮肤中黑色素的含量。皮肤暴露在阳光下的区域，例如脸部、颈部、上胸部、手和前臂，是这些变化最常发生的部位。太阳光是紫外线（200～400 nm）辐射的主要来源。其中包含UVC辐射（100～290 nm），它几乎完全被臭氧层吸收，并且不影响皮肤； UVB（290～320 nm）会影响皮肤（表皮）的浅表层，并导致晒伤；UVA（320～400 nm）被认为对皮肤的影响是次要的，但研究表明它们在皮肤中的渗透更深，会造成更严重的损害[3]。

紫外线还直接或间接引发和激活人体皮肤中复杂的生物化学反应。此外，紫外线诱导的活性氧（ROS）会干扰信号通路。在分子水平上，紫外线激活皮肤中角质形成细胞和成纤维细胞的细胞表面受体，从而启动信号转导反应，导致细胞外基质中胶原蛋白的分解和新胶原蛋白合成的关闭[4]。紫外线诱导皮肤中ROS的释放，激活了细胞表面细胞因子和生长因子受体来刺激众多信号转导途径。UVA或UVB诱导活化（有时通过过氧化物或单线态O2作为信号分子）皮肤细胞中多种转录因子，包括因子激活蛋白1（AP-1）。AP-1诱导基质上调金属蛋白酶（MMP），例如胶原酶-1（MMP-1）、基质溶酶-1（MMP-3）和明胶酶A（MMP-2），它们会降解结缔组织，例如胶原蛋白和弹性蛋白，并间接抑制胶原蛋白的合成。胶原蛋白的破坏是光老化的标志。实验证实，在紫外线照射后8小时内胶原蛋白的合成减少[5-7]。Fagot等[8]的研究揭示皮肤的UVA / UVB照射会在15 min内产生H2O2, 而H2O2能够轻松穿越细胞膜，并与过渡Fe（II）结合，驱动高毒性羟基自由基的产生，从而引发细胞膜的脂质过氧化[9]。每次间歇性暴露于紫外线照射下，皮肤会退化并修复不完善，从而导致太阳光的积累疤痕和最终可见的光老化。虽然光老化的迹象似乎在一夜之间出现，但实际上它们隐藏在皮肤深层。皮肤受到紫外线的照射会引起氧化应激，导致发炎反应，例如急性红斑和慢性损伤。慢性损害的后果包括过早的皮肤老化和皮肤癌[9-10]。

随着现代电子科技的进步，除了阳光中的紫外线，我们被越来越多的“蓝光”包围着。最近的研究表明，蓝光（400～500 nm）对皮肤也会造成伤害。研究发现，将细胞在光照与黑暗情况下进行观察，光照组的线粒体呼吸活性降低了，严重破坏了线粒体DNA。这可能会导致细胞衰老，以及与年龄相关的病理和肿瘤的发生[11]。另有一项人体测试将9名健康志愿者暴露在蓝光下，通过一种非侵入性的方式，测试到皮肤中类胡萝卜素浓度有所下降，该研究表明，高剂量的蓝光辐射对人类皮肤可能是一个相对不利的因素。皮肤中类胡萝卜素的降解间接显示了人体皮肤中产生的自由基，特别是活性氧的数量[12]。

除了使用化学或物理防晒剂来减少到达皮肤的紫外线强度外，向皮肤补充抗氧化剂并由此增强其抗氧化能力是限制ROS引起皮肤损伤的一种可行方法。为了抵消ROS的有害作用，皮肤配备了抗氧化剂系统，该抗氧化剂系统由多种抗氧化剂组成一个“抗氧化剂网络”。非酶类抗氧化剂可分为脂质分子和水溶性分子。生育酚（VE）和β-胡萝卜素（VA的前体）是主要的脂溶性非酶抗氧化剂。它们主要定位于细胞膜和LDL。VE的最活跃形式是α-生育酚，它可以打破自由基链反应。生育酚除了具有抗氧化作用外，还可抑制已经开始的脂质过氧化作用。β-胡萝卜素主要通过激发单线态氧而与之相互作用。抗坏血酸（VC）是主要的水溶性非酶抗氧化剂。它与多种自由基在细胞内相互作用，并形成针对血浆中自由基的一线细胞外防御。研究表明，局部应用抗氧化剂提供了一种提高人表皮中抗氧化剂组织水平的有效方法[13]。

1 维生素A

类视黄醇家族包含维生素A（视黄醇）及其天然衍生物，例如视黄醛、视黄酸和视黄酯，以及合成衍生物。视黄醇是由20个碳原子组成的分子，由环己烯基环，连接4个双键（均处于反式构型）的侧链和一个醇端基组成，因此被称为全反式视黄醇。视黄醇中醇端基氧化形成醛（全反式视黄醛或视黄醛），该醛可进一步氧化为羧酸（全反式视黄酸或维甲酸）。

这些脂溶性维生素不能人体合成，而且需要胆盐、脂肪和胰脂肪酶来分解后才可以被人体吸收[14]。原维生素A的主要形式包括β-胡萝卜素和视黄醇酯，它们被肠道消化吸收后，被运输到肝脏并作为视黄酯形式储存。在角质形成细胞中发现类视黄醇有两种形式：视黄醇和视黄酯。这些亲脂性的有机化合物对上皮细胞分化、免疫调节、生殖和视力都很重要[15]。

自1984年以来，全反式视黄醇已用于OTC化妆品。Kang等表明，在正常人皮肤上应用全反式视黄醇可诱导表皮增厚并增强CRABP II和CRBP mRNA和蛋白质的表达时，它在光老化治疗中的潜力得以实现。已有的研究表明，视黄醇抑制紫外线诱导的MMP，并刺激光老化皮肤的胶原合成。在1998年首次进行了视黄醇制剂的对照临床实验，并观察到使用视黄醇制剂治疗12周后，皱纹得到显著改善。随后，研究了局部应用1%视黄醇在53例80岁或以上皮肤老化的效果，并观察到视黄醇应用7天可降低基质MMP活性，金属蛋白酶、胶原酶和明胶酶的表达伴随着成纤维细胞生长和胶原蛋白的增加。因此得出结论，即视黄醇是治疗老化和光老化的有效药物[16]。光损伤的皮肤会表现出脆弱性和容易剪切或撕裂，本质上老化的皮肤也表现出这些特征。因此，人们怀疑基底膜区蛋白减少、表皮萎缩和血管脆弱性增加是导致这些变化的原因。局部视黄醇可以增加VII型胶原和微纤维，增加表皮和真皮之间的物理联系。此外，血管生成和皮肤血流的增加可以改善皮肤炎愈合时间[17]。

2 维生素E及其衍生物

天然维生素E是一类脂溶性抗氧化物，可使生物膜（细胞膜、线粒体膜）避免发生脂质过氧化反应，使生物膜的信息传递、通透性、酶活力保持正常。维生素E在皮肤的角质层中尤其丰富，角质层作为人体的最外层防御，首先受到光和污染的氧化应激。通过这种暴露，维生素E会被消耗，因此局部应用特别有利。

维生素E（α-生育酚）的光保护作用已得到广泛研究[18]。在动物研究中，暴露于紫外线下的维生素E可以显著降低急性皮肤反应，如红斑和浮肿、晒伤细胞形成、脂质过氧化、DNA加合物形成、免疫抑制以及UVA诱导的光敏剂结合。局部维生素E也减少了由于长期暴露于UVR而引起的皮肤肿瘤发病率。一项人体研究证明，通过测量色度计a*值（代表红斑的发红）和皮肤血流量，含有2%α-生育酚醇剂可显著减少红斑反应[19]。 在UVR暴露前30 min以2 mg /cm2的剂量涂抹乳液，由于该乳液没有明显的防晒性能，因此观察到的光保护作用可能归因于α-生育酚的抗氧化特性。临床上，局部维生素E确实可以减少光老化产生的皱纹和日晒斑。在组织学上也证实了其存在光老化的逆转：显微镜检查显示，维生素E能减少由紫外线引起的表皮肥大，角质层增厚，“晒伤细胞”增多的生理现象。进一步的电子显微镜分析证实了维生素E能对抗胶原蛋白和弹性蛋白纤维的损伤，并对紫外线诱导的基底膜锚定纤维破坏有修复作用[20]。

3 维生素C

维生素C，也称作抗坏血酸，是一种α-酮内酯。在生理pH下，它以单价羟基阴离子形式存在，具有理想的自由基清除剂的许多特性。首先，它在人体中的很多组织中存在，并且供应充足。第二，它可以在细胞或某些组织内积聚。第三，在体内它可循环作用。抗坏血酸通过逐步提供两个电子后，被氧化为脱氢-L-抗坏血酸（DHAA）。捐献一个电子后的中间化合物是抗坏血酸自由基。DHAA可以被还原为抗坏血酸；该反应可以被DHAA还原酶催化，或者分解成2,3-二酮葡糖醛酸。第四，抗坏血酸是一种多用途的抗氧化剂，除单线态氧外，还可以与超氧化物和羟基自由基相互作用[21]。

皮肤中表皮层含有3.8 umol/g的维生素C，几乎是真皮层的5倍之多。不过暴露于阳光和环境污染会损耗皮肤中的维生素C[22]。即使在紫外线照射计量为1.6MED（最小的红斑剂量 ）的情况下，维生素C的水平也会降至正常水平的70%，而暴露于10 MED会使维生素C的水平仅为54%。在城市污染中暴露于10 mg/m3的臭氧会使表皮维生素C的含量降低55%[23]。

维生素C对皮肤有很多好处，最重要的是胶原蛋白的合成和光保护。维生素C是胶原蛋白合成过程中所需的脯氨酰羟化酶（稳定胶原蛋白分子）和赖氨酰羟化酶（产生结构强度交联）两种酶的必要辅助因子。通过增强胶原蛋白的合成，维生素C具有抗衰老作用。体外研究比较了新生和老年（80～95岁）成纤维细胞[24]，老年细胞在体外仅以新生细胞速率的五分之一增殖。但是，当将维生素C添加到培养基中时，老年细胞的增殖比正常新细胞好。新生成的成纤维细胞暴露于维生素C的情况下，也几乎提高了4倍。人体测试中，将绝经后的妇女一侧手臂和脖子使用5%的维生素C，而另一侧则使用安慰剂，使用VC侧的胶原蛋白I和III的mRNA表达增加[25]。最近的研究进一步表明，维生素C也可直接作用于DNA以增加转录速率并稳定前胶原信使RNA，从而调节和维持胶原蛋白的细胞间含量[26]。

维生素C虽然不是防晒剂，但是已被证明具有一定的光保护作用。在猪模型中，将10%的VC水溶液多次施用于动物皮肤，然后用400 mJ/cm2UVB照射，并在24 h后取样。通过组织学确定晒伤细胞数，并观察到治疗和未治疗皮肤的晒伤细胞数量均显著减少[27]。但是，作为抗氧化剂，它可以使紫外线诱导的自由基失活，并使紫外线B红斑减少52%。这种保护作用在组织学上得到了证实：局部用10%的维生素C处理可将异常的“晒伤细胞”数量减少40%～60%。每天用15%的维生素C，治疗1年后，皱纹和斑驳的色素沉着明显减少，皮肤获得健康、年轻的光彩[28]。

4 维生素A、C、E混合使用的协同作用

Seite等[29]进行了两项双盲研究，局部应用视黄醇加维生素C组合对衰老或光老化皮肤的表皮和真皮的影响进行研究。两项研究针对的是绝经后女性，这些女性是根据其自身面部皮肤的弹性变形水平进行选择治疗的。治疗完成后，收集皮肤活检样品并进行处理，以进行组织学和免疫组织化学检查。在第一个研究（皮肤老化）中，有8位志愿者每天两次在一个肘部的内侧施用含视黄醇和维生素C的制剂，在另一个肘部施用空白载体，每天两次，持续3个月。治疗后，我们观察到表皮内部的组织学变化：角质层变薄，呈致密模式，而表皮增生增加，导致存活表皮增厚。在第二项研究（光老化皮肤）中，将11名志愿者分为两组。 治疗组使用含视黄醇和维生素C的制剂，对照组每天两次将其涂在脸上，持续6个月。面部皮肤样品呈现出光老化的组织学特征，即乳头状真皮中弹性物质的积累。经过6个月的局部治疗后，观察到的组织学变化主要集中在真皮水平。治疗组和对照组均显示出相似的I型胶原蛋白分布模式，但是，最初在光老化皮肤中观察到的高含量III型胶原蛋白在视黄醇和维生素C治疗组比例降低，而从使III型-I型胶原蛋白比较下降。此外，在视黄醇和维生素C治疗组中，表皮下出现大量嗜酸性物质并形成更多更大的“genz区”。实验结果表明，局部重复使用含有视黄醇和维生素C的制剂能够部分逆转自然老化和光老化引起的皮肤变化。

Burke[30]研究表明抗坏血酸还可以通过增强生育酚的活性来保护膜免受过氧化作用。通过体外研究表明，抗坏血酸降低了生育酚的自由基数量，从而恢复了生育酚的自由基清除活性，后者描述了抗坏血酸与生育酚结合的抗氧作用。在细胞中，维生素C和E协同相互作用以提供抗氧化保护。在膜中，维生素E被淬灭时会被过氧化的自由基氧化。邻近的细胞内维生素C（氧化还原电位较低）可还原氧化的维生素E，以恢复其活性，因此无需在膜中进行置换。人体局部用L-抗坏血酸（15%）和α-生育酚（1%）对紫外线引起的红斑有4倍的保护作用，减少了受损的“晒伤细胞”的数量。维生素C和维生素E结合褪黑激素对紫外线诱发的红斑的保护作用在人体测试中得到了进一步证明。

Tesoriere等[31]观察到全反式视黄醇和α-生育酚在单分子脂质体双层中的显著协同效应。胡萝卜素和类维生素A被认为是非传统的断链抗氧化剂，因为它们不是通过提取H原子起作用，而是通过在共轭多烯键中添加过氧自由基（包括脂过氧自由基）来起作用，从而产生一个共振稳定的碳中心自由基。以碳为中心的自由基在两个自氧化和一个抗氧化剂之间的分配将决定这些化合物有效清除过氧自由基的总体能力。当将全反式视黄醇单独掺入脂质体系统中时，其表现出的抗氧化效果很差，这可以通过考虑全反式视黄醇的多烯链在脂质部分内部深处的位置以及脂质过氧化的自催化性质来解释。自由基是通过AAPH从脂质双层外部产生的，在脂质体表面上对脂质的快速攻击会产生大量的支链化起始位点和脂质过氧化氢，然后才通过全反式视黄醇有效地清除脂过氧自由基。后者则主要通过自身氧化消耗。换句话说，在这种情况下，全反式视黄醇的抗氧化能力被湮没。当生育酚和全反式视黄醇一起起作用时，视黄醇消失的时间过程会延长，同时脂质氢过氧化物的产生也随之减少。该证据可能表明，通过保护全反式视黄醇免于自身氧化，生育酚可使视黄醇成为更有效的脂氧酰自由基清除剂。当添加的生育酚的含量远低于胡萝卜素时，在胡萝卜素和生育酚之间的微粒体膜中未观察到协同作用，而当抗氧化剂的含量大致相等时，抗氧化剂提供了协同保护作用。

5 结论

长期暴露于紫外线和蓝光下的皮肤会发生光老化，皮肤变得粗糙、暗沉、失去弹性，甚至有患皮肤癌的风险。除了使用防晒剂来吸收紫外线之外，大量的体外和人体实验表明，一些维生素及其衍生物可以抵御光老化，而且它们组合使用的效果可以大大提升。联合使用VA、VC和VE不仅可以大大降低光照产生的ROS，同时还可以增加皮肤合成胶原蛋白的能力。这种多维的方式可提升抵抗光老化的能力。不仅如此，在产品中使用“天然”光保护剂可以降低合成防晒剂的用量，从而降低对皮肤的刺激，同时达到事半功倍的效果。