南方红豆杉组培快繁技术研究进展

张文泉，邓 洁

(凯里学院，贵州 凯里 556011)

南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)属红豆杉科(Taxaceae S.F.Gery)红豆杉属(Taxus Linn.)植物，又名美丽红豆杉，为国家一级重点保护野生植物，多分布于分布于长江流域及陕西、甘肃等地。其木材红色，材质细密，为珍贵的红木树种；其树形优美，四季常青，果实红色，观赏价值极高；尤其是南方红豆杉内含紫杉醇(Paclitaxe)为特效抗肿瘤药物，对于乳腺癌、前列腺癌等非小细胞性肿瘤及类风湿性关节炎的治疗具有显著疗效[1-6]。南方红豆杉体内紫杉醇含量远高于东北红豆杉，最高可达0.02%以上[2]，具有极高的开发利用价值。由于市场需求量巨大，野生南方红豆杉植物资源极其匮乏，远难以满足市场要求。因此大力发展南方红豆杉产业可解决生产紫杉醇原料缺乏问题，更进一步有效保护南方红豆杉野生资源具有重大意义。

目前有关南方红豆杉的研究主要集中于对其种植技术、紫杉醇的化学提取合成和化学修饰和基因工程等方面。对于南方红豆杉组织培养的研究始于20世纪90年代，多集中于愈伤组织诱导和细胞培养。迄今已有大量文献报道[1-22]，主要包括两个层面：一是利用微繁技术大量生产组培苗以用于人工栽培造林；二是通过愈伤组织诱导及细胞悬浮培养，从中直接提取紫杉醇，用于药物生产。本文对南方红豆杉组织培养进行综述，旨在为南方红豆杉资源的进一步研究、开发利用提供参考。

1 外植体

因南方红豆杉为裸子植物，又属木本，因而愈伤组织诱导难度较大。我国对于南方红豆杉组织培养技术的研究开始于20世纪90年代，张宗勤等以南方红豆杉枝条为外植体，成功诱导南方红豆杉的愈伤组织[1]。迄今，据报道，南方红豆杉组织培养的研究主要集中在愈伤组织诱导及细胞悬浮培养，因为从悬浮培养系中可大量提取南方红豆杉的活性物质紫杉醇。外植体较多使用茎段与枝条，也常见采用使用芽、叶和成熟种子胚适宜的外植体有茎段、枝条芽、叶和成熟种子胚，但以茎段、芽为主[2-9]。苏应娟[3]、杨礼香等[7]在南方红豆杉愈伤组织的诱导和培养中采用芽与茎段为外植体，经比较发现，同等条件下芽的愈伤诱导率高于茎段，愈伤组织出愈时间早于茎段，且生长速率快、污染率低，茎段愈伤诱导率可达到100%。邱德有[9]等采用南方红豆杉成熟种子胚，诱导得到胚性愈伤组织，并成功获得体细胞胚。

无菌外植体的获得多采用消毒灭菌相结合的方式，采集回的外植体流水冲洗后，通常采用75%乙醇和0.1%～0.3%升汞或次氯酸钠配合使用，75%乙醇消毒时间控制在30 s左右，灭菌时间3～15 min不等，消毒灭菌其时间长短及所有消毒液的浓度视外植体情况而定，如茎段等外植体污染较严重，成熟度较高，采用毒性较大升汞为消毒剂，浓度可较高，消毒时间可适当延长，而叶片和茎段等幼嫩而且污染率相对较低的外植体时用毒性小的次氯酸钠等较为适宜，消毒时间消毒液浓度均可适当降低等[1-9]。

综上所述，茎段因取材方便、外植体来源广泛、细胞分化能力较强等特点成为南方红豆杉诱导愈伤组织最常用外植体。

2 培养条件

2.1 基本培养基

南方红豆杉组织培养过程中，基本培养基的类型起至关重要，南方红豆杉愈伤组织诱导最常用MS、B5两种基本培养基[1-3,5-6,8-10]。张宗勤等[1]以改良MS（增加硝态氮的含量，降低铵态氮的含量）为基本培养基诱导的得到的愈伤组织生长情况优良，体积较大，呈颗粒状，质地疏松、不易褐化。陈永勤等[2]通过改良B5培养基，提高有机物质中VB3浓度提高至1.25 mg/L，并添加1.0 mg/L的VB1，可提高愈伤组织诱导率至100%，且可提高愈伤组织的分化率，邱德有等[9]利用改良B5培养基成功诱导出南方红豆杉的胚性愈伤组织愈伤组织。章国瑛等[5]报道，在黑暗条件下诱导愈伤组织，B5培养基愈伤组织诱导率高于基本MS培养基。苏应娟等[3]报道，在愈伤组织的阶段，B5培养基更适合愈伤组织增殖生长。体现出南方红豆杉组织培养各个阶段对营养物质的要求不尽相同，在愈伤组织诱导及培养过程中，对MS、B5培养基进行改良后，效果较好。

2.2 激素

植物生长调节剂是植物组织培养能否成功的关键所在，不同激素种类的组合与不同浓度和配比显著影响植物组织培养过程中细胞分裂与发育。南方红豆杉组织培养过程中，生长素常用2.4-D与NAA，细胞分裂素常用6-BA、KT。将两类激素配合使用，充分体现出激素组合的优势[10-16]。不同的培养阶段及不同的外植体所采用的激素组合及激素浓度不尽相同。在南方红豆杉愈伤组织诱导阶段，生长素浓度与分裂素浓度比例通常大于10∶1。章国瑛等[5]报道：采用改良B5+3.0 mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA，用茎段作外植体诱导愈伤组织，愈伤组织诱导率达100%。张宗勤等[1]采用NAA可以替代2.4-D，同样可诱导得到质量较高的愈伤组织，可规避2.4-D本身具有致癌活性而影响组织培养获得南方红豆杉中紫杉醇的药用风险。杨礼香等[7]报道：采用改良MS+2.0 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L NAA，用茎段作外植体诱导愈伤组织，愈伤组织诱导率高达100%，而且出愈快，第5 d即形成愈伤组织，愈伤组织增殖过程中采用改良MS+0.5 mg/L 2.4-D,1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L KT愈伤组织的生长率达到7.74 g/L，以幼嫩的芽作为外植体时，只需添加适宜浓度的2.4-D与NAA即使未加入任何细胞分裂素也可使愈伤组织诱导率高达100%。苏应娟等[3]研究表明分裂素高浓度的KT，GA3对南方红豆杉愈伤组织的诱导与生长均存在抑制作但采用低浓度的KT会明显的改善愈伤组织的质地，使其结构变得疏松，呈颗粒状，低浓度的GA3可缓解南方红豆杉愈伤组织的褐化现象，这是因为GA3能抑制POD和PPO的活性,从而降低褐化率。

2.3 其他

2.3.1 碳源。在植物组织培养过程中，大多使用蔗糖为碳源，不例外，在南方红豆杉组织培养中，通常采3%的蔗糖作为碳源。赵芳等报道[6]：在以嫩枝为外植体，MS为基本培养基采用最佳植物激素浓度组合条件下，分别添加3%的蔗糖、果糖和葡萄糖，最终统计愈伤组织诱导率及生长量得出：蔗糖作为碳源优于果糖和葡萄糖。由此得出：南方红豆杉组织培养中最适碳源为蔗糖。

2.3.2 光照条件。通常条件下，暗培养有利于植物愈伤组织的诱导，同样，诸多的研究报道表明：在南方红豆杉愈伤组织的诱导过程中，暗培养更有利于愈伤组织的诱导[3,5,9,10,17-19]，但在南方红豆杉愈伤组织的继代增殖培养中，光照反而有利于愈伤组织增殖。赵芳等[6]在暗培养及不同光照条件下对愈伤组织生长量进行了比较，当光照强度为1000～1200 lx，光照时间为12 h/d条件下不但促进愈伤组织的生长，而且减轻愈伤组织的褐化。

2.3.3 小分子物质。植物组织培养过程中，添加一些小分子物质或天然营养物质，有利于组培过程的顺利进行[17,20-21]，如在培养基中添加苯丙氨酸、乙酸钠、椰乳、香蕉汁等，盛长忠等[10]发现：在B5基本培养基中添加苯丙氨酸和乙酸钠这两种小分子物质，以叶片为外植体诱导愈伤组织，虽然对愈伤组织诱导及生长影响不显著，但对愈伤组织中紫杉醇的含量显著提高，甚至可达到对照组的3倍以上。陈惠等[11]研究表明，在培养基中添加根皮苷这一物质也有利于南方红豆杉愈伤组织诱导及生长。

3 问题与展望

迄今为止，南方红豆杉组织培养获得了较大进展，愈伤组织诱导率较高，微繁及细胞培养技术基本成熟，基本建立了以腋芽增殖方式构建的再生体系[6,20-24]，但通过愈伤组织分化构建植株再生体系的途径由于愈伤组织分化率较低还有待进一步研究。

目前，南方红豆杉组织培养急需解决的关键问题是愈伤组织的褐化及完整的植株再生体系的建立。由于在愈伤诱导时外植体中的多酚氧化酶被激活导致细胞代谢发生一系列变化，出现褐化现象，与诸多木本植物一样南方红豆杉愈伤组织在培养过程中极易出现褐化现象，愈伤组织出现褐化后会导致细胞活力降低、增殖生长缓慢直至死亡，因此褐化现象成为了限制南方红豆杉组织培养的瓶颈所在，采用哪些技术减轻和控制南方红豆杉组培过程中的愈伤组织的褐化问题成为关键所在。目前常采用的技术有：选用较为幼嫩的外植体，适宜的培养基及激素组合，在培养基中加入活性炭、抗坏血酸等均对愈伤组织的褐化能起到一定的抑制作用[23，25]。但活性炭属于酚类吸收剂，在吸收组培过程中所产生酚类物质的同时也吸附培养基中所含的有限的无机盐和植物激素，导致培养基中能供愈伤组织生长的营养物质减少，愈伤组织的生长缓慢；抗坏血酸属于还原剂，也会影响愈伤组织生长。因此，如何保证南方红豆杉愈伤组织正常生长的同时尽量降低愈伤组织的褐化，是后续南方红豆杉组织培养中急需解决的关键问题。

通过植物组织培养生产组培苗不受时间、地域、气候、土壤等因素的影响，可实现大批量的苗木生产，实现工厂化育苗，还可以通过微茎尖培养获得脱毒苗[26]，对珍稀濒危植物保护具有重大意义。南方红豆杉属于国家一级重点保护野生植物，目前由于对紫杉醇的需求日益增加，对原生南方红豆杉而破坏加剧，虽然通过组培途径诱导愈伤组织后进行细胞培养可大量获得紫杉醇，但远满足不了需求，因此如果能通过组培途径生产大量苗木，为后续持续提取紫杉醇开辟了更广阔的渠道。然而，据目前的研究报道，对南方红豆杉组织培养的研究多处于愈伤组织诱导和增殖阶段，尚未实现真正意义上的完整的植株再生。但有报道东北红豆杉、云南红豆杉、欧洲红豆杉通过愈伤诱导途径获得完整再生植株的报道[11,26]。可否借鉴其技术方法对南方红豆杉愈伤组织诱导及植株再生进行研究构建完整的植株再生体系，是后续南方红豆杉组织培养的研究重点之一。