双重实时荧光定量PCR法检测腹泻中病毒的价值

樊永慧

近年来研究表明[1]，引起人类非细菌性胃肠炎的重要病原是诺如病毒，其引起严重的食品安全、公共卫生问题，据不完全统计[2]，≥95%急性病毒性胃肠炎暴发，是由诺如病毒导致的，传染性较高，传播方式有：粪便-口途径传播、人-人之间直接传播，严重影响世界公共卫生。经调查研究显示[3]，腹泻是临床常见的消化内科疾病，是指：与平日习惯频率比较，排便次数增加、粪质稀薄及水分增加等，排便量≥200 g/d，或者含有未消化食物、黏液及脓血等，患病后常有排便急迫感、肛门不适及失禁等症状表现，发病机制较复杂，可能与病毒、细菌及寄生虫引起肠道感染等因素有关，其中引起感染的主要病毒是GⅠ型、GⅡ型诺如病毒，因此探寻经济、有效及可行的检测方法，逐渐成为医学界研究热点。张濛等[4-5]认为，采用双重实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR，polymerase chain reaction）法能控制疾病进展、改善患者预后，具有操作简便、快速及特异性强等优势，临床应用较广泛，得到患者的青睐、认可，基于上述背景，本研究分析腹泻患者粪便中诺如病毒（GⅠ+GⅡ）行双重实时荧光定量PCR法检测的价值，报道如下。

1 资料和方法

1.1 基线资料

研究2019年1月—2020年3月我市人民医院送检的腹泻患者的粪便标本共400份，其中男性有210例，女性有190例，年龄41～68岁，均值（52.39±6.42）岁；体质量19～26 kg/m2，均值是（23.29±5.47）kg/m2。（1）采集粪便的标准：腹泻病程≥2周；排便次数≥3次/日，粪便呈稀便、水样便、脓血便及黏液便等；患者表现为不同程度排便次数增加、腹痛等不适症状[6]；体征平稳、意识清晰；患者知情并签署“知情同意书”；医院伦理委员会审核同意。（2）排除标准：心肝肾功能障碍者；细菌性感染后的腹泻粪便标本；伴恶性肿瘤者；认知、精神障碍者；临床资料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 粪便采集 采集患者粪便标本5～10 g，未加入任何培养基、试剂，等待30 min后冻存于零下20℃的冰箱，尽量≤1个月内完成检测。采用0℃冰壶运送标本，阳性粪便标本：经江苏省句容市疾病预防控制中心复核后，确认为诺如病毒GⅠ和GⅡ阳性的粪便样本，采用PBS稀释为10%病毒悬浊液，冷存于零下80℃等待检测[7]。

1.2.2 仪器及试剂 涉及仪器有：高速台式冷冻离心机（德国Sigma，2～16K）、荧光定量AB7500 PCR仪（美国ThermoFisher分析仪器股份公司）、病毒核酸提取试剂盒及PCR检测试剂盒。

1.2.3 提取RNA病毒 利用病毒核酸提取试剂盒+快速柱式提取法，提取粪便标本的病毒核酸，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 双重实时荧光定量PCR法 涉及试剂有：诺如病毒（GⅠ+GⅡ））双重实时荧光定量PCR检测试剂盒（上海之江公司），PCR反应按照试剂盒说明书操作，总体积是20 μl，划分为 18 μl荧光反应液、1 μl酶混合物和 1 μl内部对照，将样品RNA处理后，荧光反应利用荧光定量PCR仪进行。（1）条件：温度45℃、持续10 min、反转录，进行1个循环；（2）预变性：温度为94℃、持续2 min、进行1个循环；（3）PCR扩增：温度为94℃、持续15 s、进行40个循环，60℃延伸时，对荧光信号进行收集；（4）报告基团：具体设置成FAM、VIC，其中GⅠ型诺如病毒采用FAM基团监测，GⅡ型诺如病毒采用VIC基团监测[8-9]。

1.3 观察指标

（1）试验有效性：①试验有效：阴性对照的FAM、VIC通道均为阴性；②阳性对照的FAM、VIC通道均呈扩增。

（2）FAM通道：Ct值＜38，GⅠ型诺如病毒核酸呈阳性，Ct值若显示为无，则表示样本呈阴性，说明GⅠ型诺如病毒核酸呈阴性，Ct值处于38～40时，表示再次进行试验，重复扩增曲线呈扩增，表示GⅠ型诺如病毒呈阳性，反之呈阴性。

（3）VIC通道：Ct值＜38，GⅡ型诺如病毒核酸呈阳性，Ct值若显示为无，则表示样本呈阴性，说明GⅡ型诺如病毒核酸呈阴性，Ct值处于38～40时，表示再次进行试验，重复扩增曲线呈扩增，表示GⅡ型诺如病毒呈阳性，反之表示样本呈阴性[10]。

2 结果

本研究选择400份腹泻患者的粪便标本，实行双重实时荧光定量PCR法检测发现，GⅠ型诺如病毒感染有15例，检出率是3.75%；GⅡ型诺如病毒感染有59例，检出率是14.75%；GⅠ型、GⅡ型诺如病毒混合感染有6例，检出率是1.50%，诺如病毒的总检出率是20.00%。

3 讨论

腹泻是临床常见症状，俗称为“拉肚子”，常因细菌性痢疾、败溃疡性结肠炎、血吸虫病、病毒性肠炎及麦角性肠病等疾病引起的，具有起病急、迁延难愈及反复发作等特点，发病时常有排便急迫感、肛门失禁及肛门不适等症状表现，未及时治疗影响患者预后效果、甚至危及生命，因此早期合理的检测方法，受到临床高度重视。近年来研究表明[11-12]，诺如病毒是引起腹泻的重要原因，传播途径有：食物、水源及人群接触等，是诱导急性病毒性胃肠炎、食源性疾病暴发的重要原因，具体分析如下：（1）急性病毒性胃肠炎其属于自限性疾病，患病后患者常有恶心呕吐、腹泻等症状表现，一般情况下呈脓血、水样便等，一年四季均可能发病，其中秋冬季较多见，发病率较高，极易被误诊，若患者多次、大量腹泻，引起严重脱水、电解质紊乱，部分群体产生休克、昏迷及心跳停止等，甚至危及生命；（2）食源性疾病常见疾病类型是食物中毒，是指：食用生物性、化学性有害物质污染的视频，出现急性、亚急性食源性疾病，在气温较高的夏秋季发病率就较高，具体划分成：细菌性食物中毒、非细菌性食物中毒，具有发病率高、迁延难愈等特点，患病后患者常表现为恶心呕吐、腹泻及腹痛等胃肠炎症状，未及时治疗引起脱水、酸中毒及休克等，甚至危及生命，因此王强等[13]认为，选择操作简便、特异性较强、重复性良好及时效性强等优势的检测方法迫在眉睫。

有研究报道[14]，双重实时荧光定量PCR法检测GⅠ型、GⅡ型诺如病毒具有较高的时效性，其中GⅠ型诺如病毒特异性采用Taqman探针的5’端标记为FAM，GⅡ型诺如病毒特异性采用Taqman探针的5’端标记为VIC，将相关标本放置于同一反应管，同期开展标本检测、分型，确保数小时内获得诺如病毒的病原体型别、缩短检测时间，将错综复杂的检测步骤简化，提高诺如病毒检测效率，具备较高的临床应用价值。

经调查研究显示，检测诺如病毒是疾病监测体系的重要组成部分，回顾分析患者既往饮食调查史，结合病毒病原体检测数据、网络上报体系，实施追溯疾病诱因、传染源，及时发现并控制病毒引起的疾病暴发，有效治疗、预防并控制诺如病毒引起的疾病，改善患者预后效果、稳定病情。

本研究示：选择400份腹泻患者的粪便标本，实行双重实时荧光定量PCR法检测发现，GⅠ型诺如病毒感染有15例，检出率是3.75%；GⅡ型诺如病毒感染有59例，检出率是14.75%；GⅠ型、GⅡ型诺如病毒混合感染有6例，检出率是1.50%，诺如病毒总检出率是20.00%，与陆芸等[15-16]文献结果接近。

综上所述，腹泻患者的粪便采用双重实时荧光定量PCR法检测具有较高的临床应用价值，为后期治疗提供可靠性保障、改善预后效果。