VBNC状态微生物与食品发酵的研究进展

文 霞， 陈漪汶， 张淑瑶， 谢小保

广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东 广州 510070

1 VBNC的研究现状

活的但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态是微生物的一种生存策略，在这种状态下，微生物不能在常规培养基上生长，但是其生命状态是活的，可以以呼吸或发酵形式表现出活跃的新陈代谢和蛋白质合成功能。在适宜的条件下，微生物可以恢复到可培养状态[1]。一般的不利于生长的环境条件可诱导微生物进入VBNC状态，如不适的温度[2,3]、pH(酸性环境)[4]、光照(紫外线、辐射等)[5,6]、高压[7]、高盐[8]、缺氧[9]、保存方式[10]等；另外，各种化学试剂也可促使VBNC状态微生物出现，如在食品和医疗卫生行业，已有研究报道抗微生物剂(防腐剂、抗生素)可促进VBNC状态微生物大量产生[11,12]。ROBBEN等用630种表面活性剂/盐组合物进行的筛选研究表明，表面活性剂与单核细胞增生李斯特氏菌Listeriamonocytogenes、大肠杆菌Escherichiacoli、肠道沙门氏菌血清变种Salmonellaentericasubsp.enterica、鼠伤寒沙门氏菌Salmonellatyphimurium，金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus和产生毒素的肠致病性大肠杆菌enteropathogenicE.coli中的VBNC诱导和疏水性之间存在相关性[13]、氯处理可诱导大肠杆菌进入VBNC状态[14]、SO2可诱导乳酸菌进入VBNC状态[15]。研究发现压力环境会导致毒素和抗毒素蛋白之间的比例失调，影响蛋白质的合成和分裂，从而导致生长停滞和休眠[16]，如Ⅱ型毒素-抗毒素系统(TAS)在诱导VBNC状态中起重要作用[17]，VBNC状态诱导的另一个因素是在培养期间过氧化氢酶的损失[18]，暴露于单氯胺后VBNC状态的大肠杆菌转录相关基因下调3倍，蛋白质合成代谢减少，应激反应相关基因(rpoS，uspA)下调[19]。

细菌在VBNC状态下的特征有如下几点：1)维持明显的细胞完整性；2)具有某种形式的可测量的细胞活性[20]；3)具有可恢复培养性的能力[21]；4)通过特定基因表达对外部刺激作出反应[22]；5)代谢活性低[23]；6)细菌形态变化，表现出比正常细胞短小的形态[24]；7)营养物质的运输减少；8)ATP含量高且具有较高的膜电位[25]；9)对细胞质膜中的脂肪酸组成进行了广泛的修饰[26]；10)细胞壁肽聚糖内，交联增加，带有共价结合脂蛋白的多肽增加，聚糖链的平均长度缩短[27]；11)比成倍增长的细胞具有更高的自溶能力；12)保留质粒；13)增加抗生素抗药性，降低代谢活性[28]；14)外膜蛋白质谱的变化[29]；15)连续基因表达[30]。由于复苏和表型研究难以区分VBNC细胞和休眠细胞，VBNC状态一直存在争议[31-33]。无论是VBNC还是持续性细胞，都是微生物的一种生存方式，都具有传统平板培养法无法检出的特点，同时具有可复苏的能力，基于这些特性，只要涉及到与微生物相关的行业，都会有VBNC状态微生物的存在。如在食品发酵行业，如果微生物进入VBNC状态，不仅影响发酵产物的产量和质量，而且发酵食品中一些有害微生物的存在会对人体健康造成威胁。

2 用于食品发酵的微生物种类

发酵食品是微生物群落作用的产物，因为它们以未经加工的植物或动物为底物，与器皿，容器和环境中的天然微生物群落之间进行相互作用或加入含有功能性微生物的发酵剂。微生物在发酵过程中改变了原料的化学成分，丰富了一些发酵食品的营养价值，给消费者的健康带来了益处。乳酸菌广泛存在于许多发酵食品和饮料中[34]，目前从全球各地分离出来产乳酸的乳酸菌属主要有Alkalibacteriumsp.，肉食杆菌属Carnobacteriumsp.，肠球菌Enterococcussp., 乳杆菌属Lactobacillussp.，乳球菌属Lactococcussp.，明串珠菌属Leuconostocsp.，酒球菌属Oenococcussp.，片球菌属Pediococcussp.，链球菌属Streptococcussp.，四链球菌属Tetragenococcussp.，漫游球菌属Vagococcussp.和 魏斯氏菌属Weissellasp.[35]；芽孢杆菌主要存在于碱性发酵食品中[36]，种类有解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、环状芽孢杆菌Bacilluscirculans、凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans、坚强芽孢杆菌Bacillusfirm、地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis、巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium、短小芽孢杆菌Bacilluspumilus、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、和苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis等[37]，微球菌属Micrococcussp.和葡萄球菌属Staphylococcussp.从发酵的牛奶、香肠和鱼中分离出来，双歧杆菌属Bifidobacteriumsp.、短状杆菌属Brachybacteriumsp.、短杆菌属Brevibacteriumsp.和丙酸杆菌属Propionibacteriumsp.从奶酪中分离出来[38]，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、盐厌氧菌属Halobacteriumsp.、盐球菌属Halococcussp.、丙酸杆菌属Propionibacteriumsp.、假单胞菌属Pseudomonassp.[34]从全球的发酵食品中分离出来。另一类从发酵食品或酒精饮料中分离出的微生物是酵母菌，包括酒香酵母属Brettanomycessp., 假丝酵母属Candidasp.，隐球酵母属Cryptococcussp.，德巴利氏酵母属Debaryomycessp.，德克酵母属Dekkerasp.，耐碱酵母Galactomycessp.，地丝菌属Geotrichumsp.，汉逊酵母属Hansenulasp.，汉森氏酵母Hanseniasporasp.，丝孢毕赤酵母属Hyphopichiasp., 伊莎酵母Issatchenkiasp.，哈萨克斯坦酵母属Kazachstaniasp.等[39]。另外，丝状霉菌在发酵食品和酒精饮料中的主要作用是酶的产生和抗营养因子的降解，主要有放射毛霉属Actinomucorsp.,淀粉霉属Amylomycessp.,曲霉属Aspergillussp.,红曲霉属Monascussp.,毛霉属Mucorsp.,脉孢菌属Neurosporasp.,Parcilomycessp.,青霉属Penicilliumsp.,根霉属Rhizopussp.和黑粉菌属Ustilagosp.[40]。

3 微生物VBNC状态对食品发酵过程的影响

食品发酵环境中的微生物种群繁多，它们有不同的来源和生长需求，由于微生物极其多样且高度动态，因此在食品微生物发酵中存在的许多不同类型的微生物物种可以有多种生理状态，这些生理状态对生存和维持生长具有不同的作用。在微生物发酵过程中，水活度、酸碱度、氧化还原电位，饥饿或者使用保存的发酵剂进行发酵都可使微生物进入VBNC状态，并且持续存在。催化活性的定量化可以测量不同细胞亚型对整个发酵过程的贡献，这对生物过程的优化至关重要。尽管在标准条件下丧失了可培养性，但VBNC细胞仍然是活着的，可以维持运输系统和生物合成，并且能够进行基因表达和代谢底物。LAHTINEN等报道[41]了在发酵产品贮藏过程中含有乳双歧杆菌、长双歧杆菌和动物双歧杆菌的VBNC益生菌。MILLET和LONVAUD-FUNEL等报道[42]，葡萄酒发酵菌株Oenococcusoeni在缺乏O2的情况下可进入VBNC状态。酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae也可响应二氧化硫压力而进入VBNC状态[43]。因此，研究这些菌株在VBNC状态下的形成和复苏对其在食品发酵工业中的应用具有重要价值。

有研究者选择苹果汁苹果酸乳酸发酵(MLF)为模型系统，阐明了希氏乳杆菌LactobacillushilgardiiVBNC细胞在生物发酵过程中的作用。作者首先添加一定量的SO2诱导乳酸菌存活但不可培养的细胞亚群的产生，通过发酵动力学模型分析了活的可培养的细胞与VBNC细胞在苹果酸乳酸发酵过程中的作用，结果显示进行MLF的VBNC细胞表现出代谢活性降低的状态。在所有测试中，VBNC细胞均占总微生物数量的大部分(70%至90%)，VBNC亚群的特定苹果酸摄取率约为存活种群的50%，而与培养基组成和SO2浓度无关。这些结果可能有助于从数量上阐明VBNC亚群对发酵过程的真正贡献，该结果对于工业规模的生物过程控制和优化是有价值的[44]。

酿酒酵母是乙醇发酵最常见的微生物，但也可以引起酒类发酵产物的腐败，如布鲁塞尔酒香酵母Brettanomycesbruxellensis被认为是红葡萄酒中主要的腐败酵母菌，这对葡萄酒行业来说是一个严重的问题，因为它能够通过酶的转化，将羟基肉桂酸转化为挥发性酚，从而使最终产品产生异味，尽管在酿造过程中有很多培养技术用来检测这种酵母的存在，但在一些情况下，布鲁塞尔酒香酵母是无法检测到的，从而导致最终发酵产物受到酵母菌种产生的酚类气味的影响，造成巨大的经济损失[45]。这一现象最具有说服力的解释是布鲁塞尔酒香酵母进入了VBNC状态，无法在分离培养基中检出[46]。在葡萄酒行业，已有一些研究表明，用作食品保鲜剂的抗菌剂二氧化硫可以诱导酵母菌进入VBNC状态，并证明了酵母菌通过升高培养基的pH和从培养基中除去SO2的方式复苏到可培养状态[47,48]。考虑到种内变异性，有研究者采用荧光显微镜观察了三株布鲁塞尔酒香酵母菌株之间可培养性的差异性，旨在观察SO2与温度的最佳组合是否可以减少或消除布鲁塞尔酒香酵母引起的变质，同时利用台盼蓝染色法对基安蒂地区不同酒庄的85株酵母分离株中具有代表性的7株菌进行了分析，结果表明，布鲁塞尔酒香酵母菌经浓度为1 mg/L的SO2暴露24 h后，不同程度地诱导了不可培养状态的产生[49]。关于不同类型的高温发酵已经有了较多的研究报告，但是只有少数报告研究了高温发酵过程中细胞活力的变化。例如，以葡萄糖酸发酵为例，在38 ℃下可将葡萄糖氧化成葡萄糖酸的耐热木醋杆菌Acetobactersenegalensis，在不同碳源和生理生化条件下可进入VBNC状态。在发酵过程中，葡萄糖消耗的速率和葡萄糖酸盐产生的速率逐渐降低，这与细胞脱氢酶活性，细胞包膜完整性和细胞可培养性以及VBNC细胞形成相关。静止期细胞进入VBNC的部分原因是发酵温度高和葡萄糖的长期氧化。在静止期形成的VBNC细胞中，有约48%通过向培养基中添加其他低浓度的碳源(乙醇)和/或将培养温度降低到30 ℃而得以复苏。这表明乙醇作为一种有利的碳源，可促进VBNC细胞的复苏。由于在高温发酵过程中通常不可避免地会形成VBNC细胞，因此使用替代碳源以及不断改变理化条件可以使VBNC细胞复苏并可用于多个生产周期，从而提高发酵效率[50]。运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis可以耐受较高的乙醇浓度，其乙醇的生产速度比酵母快五倍，有更高的产量和较低的残留生物量[51]，该微生物已成为工业化生产生物乙醇的重要候选微生物[52]，有研究者认为当乙醇浓度高于临界浓度时，VBNC状态的运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis在恒化器的持续震荡中起主要作用[53]，在特定的乙醇浓度条件下，长度达到500 μm的丝状细菌会出现在持续震荡的培养液中，这些VBNC细胞能够产生乙醇，但是无法自我繁殖。

4 食品发酵中VBNC状态微生物的检测方法

由于VBNC状态微生物在食品安全及公共卫生方面的重要性，使得研发其有效的检测方法也尤为重要，特别是在食品发酵过程中，为了更好的研究发酵微生物种群的状态，需要对发酵菌种进行准确检测。当细菌进入VBNC状态时，它们通常具有两个明显的特征：细菌具有代谢活性，但不能在常规的非选择性培养基上正常生长而形成菌落。由于VBNC细胞的不可培养特性，传统的微生物检测方法无效。因此，主要基于VBNC细胞的生存能力建立了一些检测方法：(1)直接活菌计数法(DVC)，VBNC细胞进行抗生素处理(纳西地酸，氨曲南，环丙沙星等)使其伸长而不分裂，通过显微镜进行直接计数，但是，细菌对抗生素的反应在很大程度上取决于物种，有时吸收养分后不会延长，这极大地限制了这种方法的准确性[54]。(2)LIVE/DEAD Baclight染色法基于细胞质膜完整性，结合两种荧光染料SYTO 9和碘化丙啶(PI)来评估细胞活力[55]。SYTO 9(一种绿色荧光染料)可以渗透完整或受损的细胞膜，而PI(一种红色荧光染料)只能穿透受损的细胞膜并与SYTO 9竞争结合核酸。可以通过荧光显微镜或流式细胞仪(FCM)检查染色的细胞，进行细胞计数。由于VBNC细胞还具有整合的细胞质膜，因此该方法也可用于量化种群细胞。(3)分子生物学的发展使PCR成为检测细菌的最佳方法，多项研究表明，qPCR在检测发酵过程中不同的酵母和细菌方面比其他分子工具更具有特异性[56,57]。但是，普通qPCR的结果并不够准确，因为该检测只对总DNA进行定量，而没有区分死的和活的微生物。有报道在DNA提取前用叠氮溴化丙锭(PMA)处理细菌细胞后VBNC细胞可以通过定量PCR进行定量，因为PMA可以通过受损的膜与DNA结合并抑制其扩增[58]。有研究者将该方法用于检测不同食品发酵样品中的VBNC细菌，在红曲糯米酒中，植物乳杆菌为4.0×100CFU/mL，酿酒酵母为2.6×101CFU/mL，紫红曲霉为8.8×101CFU/mL[59]。NAVARRO等研究表明利用活染料PMAxx结合qPCR是一种可靠、特异、快速的混合酒精发酵种群动态的监测方法[60]。(4)其它新型检测方法：噬菌体介导的检测方法主要通过将标记的噬菌体附着到其特定细菌宿主上，使用噬菌体将可测量的标记物转运到宿主中或从宿主释放的子代噬菌体的产物中扩增[61]。另一种检测方法是使用生物传感器将生物分子转换为可测量的电或光信号输出。有报道将其用于活细胞和VBNC大肠杆菌的定量检测，该方法在10～106CFU/mL的线性范围内的LOD为22 CFU/mL，相对标准偏差为2.5%，表明有较好的重现性[62]。还有一种经济高效的检测方法是ATP荧光检测法，即细菌被裂解后通过荧光素酶的催化作用将释放出来的ATP与荧光素反应，可以记录荧光值，并将其转换为ATP浓度，其与VBNC微生物的浓度成正比[63]。

5 总结

经过数十年的研究，人们对VBNC细胞的生理、生物化学和遗传学方面的知识有了一定的了解，但其功能和生物学意义仍存在激烈的争论。对于VBNC细胞的检测、形成和复苏，还需要进行更深入的研究，尤其是在微生物发酵工程方面，VBNC状态大多数存在于一个混合系统中，包括损伤细胞、可培养细胞及并没有完全被消除的死亡细胞，干扰了VBNC细胞形成和复苏的生理特征和分子机制的研究结果和结论。另外，VBNC细胞的检测对其研究至关重要，虽然目前也发展了许多检测方法，如染料法、流式细胞术、PMA-PCR等，但是它们也有其自身的缺点。因此，需要研发快速，灵敏，廉价且易于操作的用于检测VBNC细胞的新方法。总之，在微生物发酵优化和控制过程中，尤其是食品发酵中，应充分考虑到微生物VBNC状态的存在。