规模化奶牛场临床型乳房炎病原菌的分离鉴定

刘 欢，郭 伶

（锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001）

奶牛乳房炎是一种严重危害乳品行业并普遍发生的疾病，在美国的发病率为40%，在中国的发病率高达60%～70%，造成巨大的经济损失[1-2]。在中国，每年因乳房炎造成的经济损失达30 亿元[3]，乳房炎的发病情况更严重[4-5]。奶牛乳房炎是由于乳腺发生外伤、感染等因素而导致的炎性反应，在饲养奶牛的过程中非常容易发病，并且药物治疗成本较高，属于较难进行防治和诊断的疾病之一，严重威胁着我国的动物性食品安全[6]。临床上造成奶牛乳房炎的因素复杂多样。乳房炎引起牛奶品质下降，降低奶牛产奶的性能，进而导致出现弃奶、药物治疗的费用也会随之增加，影响养殖效益。因此，必须对奶牛乳房炎的病原菌的分离鉴定采取措施，尽可能减少经济损失[7-8]。文章对奶牛乳房炎的病原菌的分离鉴定进行研究，为乳房炎中病原菌的分离鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

吊菌环、显微镜、培养箱、培养基、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、培养皿、灭菌试管等。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

乳房炎奶样采自辽宁某奶牛场。首先用温水清洗患区，用酒精棉球对乳头进行消毒，弃去头2把乳。以无菌操作的方法将适量乳汁挤入灭菌试管中,并将乳样挤在琼脂斜面上，并做好标记。采集的样品冷藏保存，并尽快分离细菌。临床型乳房炎判定标准：乳房有明显的炎症症状、乳区出现红肿热痛、挤奶时奶牛抗拒、挤出的奶样中有絮状沉淀或颜色变化[9]。

1.2.2 细菌分离

充分摇匀采集的无菌奶样，分别划线接种于普通琼脂平板、胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板、脑心浸液琼脂平板和麦康凯琼脂培养基接种划线，做好标记，置于37 ℃培养箱中24 h然后进行观察。

1.2.3 细菌涂片、染色、镜检

使用接种环取少量蒸馏水，放在载玻片的中央，选择少量可疑菌落与蒸馏水中混合均匀，干燥后进行火焰固定。进行革兰氏染色，显微镜观察。根据菌体形态、溶血情况及染色特性初步判断细菌类别，并进一步纯化和培养。

1.2.4 细菌的分离培养及形态学鉴定

选择疑似大肠杆菌，链球菌和金黄色葡萄球菌的菌落涂片，革兰染色，镜检观察染色特性、形态和菌体排列。革兰染色镜检可见到在显微镜下呈两端钝圆的淡红色短杆菌[10]，初步判断为大肠杆菌；可见单一、成对或成链的革兰氏阳性细菌，初步判断为链球菌；还可见呈革兰氏阳性葡萄串状球菌存在，初步判断为金黄色葡萄球菌。

2 结果与分析

2.1 细菌在各种培养基中的生长结果（见表1）

表1 细菌在各种培养基中的生长结果Tab.1 Bacteria growth results in various media

由表1 可知，金黄色葡萄球菌在营养琼脂上生长为圆形、光滑、略微凸起的中等大小菌落；在脑心浸液培养基上生长为圆形、中等大小菌落；而在麦康凯琼脂和胰蛋白胨大豆肉汤上则不生长。链球菌在营养琼脂上生长不良；在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中生长良好；而在麦康凯琼脂和脑心浸液培养基中不生长。大肠杆菌在营养琼脂上生长为灰白色露珠样、凸起、边缘光滑整齐的菌落；在麦康凯琼脂上生长为中等大小的红色菌落；而在胰蛋白胨大豆肉汤和脑心浸液培养基上不生长。

2.2 细菌在培养基中的形态观察（见图1～图3）

图1 金黄色葡萄球菌生长状态和形态结构Fig.1 Growth status and morphological structure of Staphylococcus aureus

图2 链球菌生长状态和形态结构Fig.2 Growth status and morphological structure of Streptococcus

由图1～图3 可知，金黄色葡萄球菌革兰染色阳性球菌，呈葡萄状排列；链球菌为革兰氏阳性球菌、无芽孢、无荚膜、菌体呈链状排列；大肠杆菌为革兰染色阴性杆菌、两端钝圆，呈红色或粉红色、无芽孢、无荚膜。

图3 大肠杆菌生长状态和形态结构Fig.3 Growth status and morphological structure of E.coli

2.3 细菌的分子生物学鉴定（见图4）

图4 分离菌株PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of isolated strains

由图4可知，分别用大肠杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌的引物扩增该分离菌DNA 后获得大小约为1 262、689和420 bp 左右的目的片段，与大肠杆菌引物、链球菌引物和金黄色葡萄球菌特异性引物预期片段大小一致，并且空白对照组无目的片段出现。

3 讨论

此次共采集乳样26份，24份分离出病原菌，分离率达到92.3%，单一菌感染占76.5%，混合感染占15.8%。对病原菌的分离鉴定可知，引起奶牛乳房炎的病原菌种类繁多并且还与地域、环境等因素密切相关。其主要致病菌是大肠杆菌、链球菌以及金黄色葡萄球菌。

本次分离结果以大肠杆菌为主，其次是葡萄球菌和链球菌。细菌的分离和鉴定是乳房炎防治技术研究的基础。乳房炎仍然是乳制品生产中最常见和最严重的疾病之一，对乳制品生产的经济效益，甚至对改善牛奶质量具有重大意义。消费者对于牛奶的质量要求越来越高，改善牛奶质量防治乳房炎已经成为研究人员普遍关注的问题。奶牛乳房炎是一种感染性疾病[11]。引起乳房炎的因素有很多，主要原因是病原微生物[12]。由于地理环境、饲养管理水平、常用抗菌药物等方面的影响，不同地理区域甚至同一地区不同牛场奶牛乳房炎病原菌的流行情况差异也很大[13]。随着人民对物质生活水平要求的提高，对乳品的需求大大增加，奶牛养殖量也逐年提升，为促进奶牛产业的稳定发展，有必要进一步加强对乳房炎的综合防治和研究。

4 结论

共采集26 份样品分离出17 个菌株，其中大肠杆菌10 株，葡萄球菌5 株，链球菌2 株，可知养殖场奶牛乳房炎是由多种病原菌引起的。