先天性巨结肠中miR-939 靶向调控SOX4 表达抑制肠神经嵴前体细胞功能表型的实验研究

田东浩 许文耀 余 辉 杨薇粒 郑百俊 高 亚 潘伟康

先天性巨结肠（Hirschsprung"s disease，HSCR）是最常见的先天性胃肠神经系统疾病之一，活产儿中发病率为1／5 000，男性发病率约为女性的4 倍，主要临床表现为病变肠管痉挛、肠内容物通过受阻引起下消化道梗阻；病理学改变为病变肠管神经节缺如以及神经纤维增粗、增多［1-4］。 其发病机制为胚胎第3 ～12 周时来自迷走神经的肠神经嵴前体细胞（enteric neural crest cells，ENCCs）沿头向尾方向迁移障碍所致［5-7］。 研究表明，多基因如SOX10、NRG1、RET、SIP1、GDNF 等参与HSCR 的发生过程，但其确切发病机制仍未完全清楚［8］。

MicroRNA （miRNA） 是内源性小分子非编码RNA，大小为19 ～25 bp，以直接结合靶基因mRNA的3"-非翻译区（3"-UTR）阻遏翻译和（或）诱导mRNA 降解的方式，参与调控细胞周期、分化、迁徙和凋亡以及能量代谢等多种细胞活动［9-11］。 既往研究表明，HSCR 患者肠组织中存在大量异常表达的miRNA，如miR-206［12，13］、miR-192／215［14］、miR-140-5p［15］和miR-132／212［16］等，它们可能与HSCR 发生相关。 研究表明，miR-939 可通过靶向HDGF 诱导WNT／β-Catenin 途径失活，还可通过靶向IGF-1R 诱导PI3K／Akt 途径失活，进而调控癌细胞增殖、迁移和凋亡，发挥抑癌作用［17，18］。 陈广林等报道miR-939 可靶向LRSAM1 并抑制HSCR 中ENCCs 增殖［19］。 SOX4 为SOX （Sry-related HMG box） 转录因子家族成员之一，广泛参与胚胎期神经元发育、轴突形成、神经元映射以及生殖系统发育等过程。有报道显示，SOX4 可能通过Notch 信号通路调控Mash1、Ngn1 和Ngn2 转录因子表达，并与SOX11 发挥协同作用［20］。 本课题组前期研究发现SOX4 在HSCR 患者肠组织中低表达［21］。 目前尚不清楚miR-939 对SOX4 的调控及二者对ENCCs 功能表型的影响，以及miR-939／SOX4 在HSCR 发病中的机制。

本研究拟通过检测miR-939 和SOX4 在HSCR患者肠组织中的表达水平，评估miR-939 对SOX4表达调控作用，以及miR-939、SOX4 对ENCCs 增殖、凋亡和迁移的影响，并探讨miR-939／SOX4 在HSCR 干预治疗中的潜在价值。

材料与方法

一、主要实验材料

孕龄15 ～20 d 的Sprague Dawley （SD） 大鼠购自广州弗尔博生物科技有限公司；DMEM／F12 培养基、胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、Lipofectamine 2000、Trizol试剂均购自美国Invitrogen 公司；Nestin、GFAP、SOX4 单克隆一抗均购自美国Abcam 公司；miR-939模拟物、SOX4 siRNA 及阴性对照试剂均购自上海吉玛制药技术有限公司；CCK8 试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Transwell 迁移室、增强的化学发光系统购自美国Millipore 公司；Annexin V-FITC ／ PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Yeasen 公司；TaqMan MicroRNA 检测试剂盒、ABI 7900HT 荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems 公司；SYBR GREEN 1 购自日本TaKaRa 公司；RIPA 缓冲液购自南京森贝伽生物科技有限公司；PVDF 膜购自美国Thermo Fisher Scientifc 公司。

二、研究方法

1． 患者组织样本采集 收集2019 年1 月至2020 年1 月在西安交通大学第二附属医院进行手术治疗的30 例HSCR 患者狭窄段（无神经节细胞肠段）肠组织，另选取30 例经手术治疗肠套叠患者的结肠非病变处组织作为对照；所有组织标本用生理盐水冲洗后保存于-80℃环境下。 HSCR 患者年龄为30 天至5 岁，男23 例，女7 例。 对照组患者年龄为1 ～5 岁，男20 例，女10 例。 两组患者基线资料匹配，具有可比性。 本研究开展前获得患者监护人的书面知情同意书，并获取我院伦理委员会批准。

2． SD 大鼠ENCCs 分离培养 参考肖莉等［22］的研究方法进行ENCCs 分离培养。 取孕15 ～18 天SD 胎鼠肠管，小心剔除肠系膜后充分剪碎，分别用胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶消化30 min、10 min，添加胎牛血清终止消化，无菌滤网过滤，于37℃下1 000 r／min 离心3 min，弃上清后PBS 冲洗3 次，完全培养基重悬并计数，按照6 ×105个细胞／mL 的密度接种到培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下培养3 ～5 d，然后传代培养。 传代5 次后进行克隆球的分化培养，取适量左旋多聚赖氨酸包被盖玻片于24 孔板中过夜，无菌双蒸水清洗3 次，600 r／min 离心2 min 离心收集悬浮神经球，0． 25% 胰蛋白酶消化5 ～10 min，轻柔吹打，制成单细胞悬液，离心弃上清，添加10%胎牛血清的完全培养基重悬，以每孔1 ×105细胞／mL 接种于24 孔板，于37℃、5%CO2条件下培养8 h，观察克隆球的分化情况。

3． SD 大鼠ENCCs 鉴定 收集悬浮生长状态良好的神经球离心，用4% 多聚甲醛固定30 min，0．5% Triton X-100 室温透膜10 min，5%胎牛血清室温封闭30 min，4℃下将盖玻片分别于1 ∶500 稀释的鼠抗Nestin 和兔抗GFAP 一抗中过夜孵育，室温复温1 h，PBS 清洗，然后与FITC 绿色和TRITC 红色荧光二抗室温孵育1 h，PBS 清洗，DAPI 染色10 min，将盖玻片置于荧光显微镜下观察细胞染色情况。

4． ENCCs 转染 收集悬浮生长状态良好的神经球于离心管中，37℃下1 000 r／min 离心3 min，弃上清，0．25%胰蛋白酶消化5 ～10 min，轻柔吹打，制成单细胞悬液，离心弃上清，用完全培养基重悬，按照2 ×105细胞／孔的密度接种于6 孔板中。 根据制造商说明书，配合使用Lipofectamine 2 000 将miR-939 模拟物、SOX4-siRNA 和阴性对照试剂转染细胞。

5． ENCCs 增殖测定 分别用miRNA 或siRNA转染48 h 后，使用CCK-8 细胞活力检测试剂盒测定细胞活力以评估增殖情况，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，记录OD 值。

6． ENCCs 凋亡测定 将miRNA 或siRNA 转染的细胞于37℃、5%CO2条件下孵育48 h 后进行收集，根据制造商说明书，使用Annexin V-FITC ／ PI 细胞凋亡检测试剂盒进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。

7． ENCCs 迁移测定 使用孔径8 μm 规格的Transwell 迁移小室进行细胞迁移分析，将转染的细胞置于完全培养基重悬，调整密度为1 ×105细胞／ml，并添加100 μL 到上室中，将600 μL 含有10%FBS 的分化培养基添加到下室中，于37℃、5%CO2条件下孵育24 h 后，用棉签小心擦拭上室，预冷PBS 清洗后，乙醇固定10 min，结晶紫染色10 min，PBS 充分清洗后，在显微镜下（ ×100）随机选择5个视野留取照片进行计数。

8． RNA 分离和qRT-PCR 按照试剂商说明书上方法使用Trizol 试剂从组织样品和细胞中提取总RNA 用于后续实验。 TaqMan MicroRNA 检测试剂盒用于检测miR-939，以U6 作为标准化对照。通过ABI 7900HT 荧光定量PCR 仪和SYBR GREEN 1 检测SOX4 mRNA 表达水平，以GAPDH 作为内参。 实验用到的引物序列如下：SOX4，正向，5"-CGAGAAAATCGGGTAGCCCA-3"， 反 向，5"-CAGATTCACTCGCAATGCCC-3"； GAPDH， 正 向 5"-GTGGAATGGTGCAGACCAAG-3"， 反 向 5"-GTCAGGAGGTGGGATGTTGG-3"。 全部实验数据采用2-△△Ct 法评估miRNA 或mRNA 的表达水平。

9． Western blot 按照试剂商说明书方法，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液从组织和细胞中提取总蛋白质。 采用Bradford 方法检测蛋白质浓度。 采用15%SDS-PAGE 分离出等量蛋白质，转移到PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶封闭，分别以1 ∶500和1 ∶1 000 的稀释度与抗SOX4 和抗GAPDH 一抗孵育，4℃条件下过夜，在室温（37℃）条件下与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 二抗共孵育1 h，使用增强的化学发光系统进行显影，GAPDH 作为内部对照。 使用ImageJ 软件对条带进行定量分析。

三、统计学处理

使用SPSS24．0 进行统计分析，实验结果中服从正态分布的定量数据以（±s）表示，所有实验独立重复3 次以上。 采用独立样本t 检验进行两组间差异性分析，采用单因素方差分析及基于Bonferroni校正的事后多重检验进行多组间差异比较，P ＜0．05 表示差异具有统计学意义。

结 果

一、ENCCs 神经球鉴定

于原代培养第3 天、第5 天在光学显微镜下观察ENCCs 来源神经球生长情况，通过Nestin 和GFAP 双免疫荧光染色对ENCCs 来源的神经球进行鉴定，结果可见神经球表现为Nestin（红色荧光）和GFAP（绿色荧光）双阳性，细胞核被DAPI 染为蓝色，Nestin+ ／GFAP+双阳性表示细胞为ENCC 细胞（图1）。

二、HSCR 患者肠组织中miR-939 和SOX4 表达

分别通过RT-PCR 检测HSCR 患者肠组织中miR-939 和SOX4 mRNA 的表达水平，通过Western blot 检测SOX4 蛋白表达水平。 结果表明，与肠套叠患者肠组织相比，HSCR 患者肠组织中miR-939 的表达水平显著增加（图2A），SOX4 的mRNA（图2B）和蛋白（图2C，图2D）表达水平显著降低。

图1 ENCCs 来源神经球光学显微镜观察结果和免疫荧光染色结果（ ×200） A：原代培养第3 天的神经球； B：原代培养第5天的神经球； C：GFAP 阳性（绿色区域）； D：Nestin 阳性（红色区域）； E：DAPI 阳性（蓝色区域）； F：染色融合Fig．1 Observation of light microscopy and Nestin／GFAP immunofluorescence staining of ENCCs neurosphere （ ×200）

图2 先天性巨结肠患者（HSCR 组）和肠套叠患者（control 组）肠组织中miR-939 和SOX4 的表达情况 A、B：RT-PCR 检测miR-939（A）和SOX4 mRNA（B）表达； C：Western blot 检测SOX4 蛋白表达； D：Western blot 条带ImageJ 定量结果； *代表与control 组比较，P ＜0．05Fig．2 miR-939／SOX4 expression in intestinal tissues of patients with Hirschsprung"s disease and intussusception

图3 上调miR-939 的表达对肠神经嵴干细胞增殖、凋亡和迁移的影响 A：转染miR-939 mimic 上调细胞中miR-939 的表达；B：CCK8 法测定细胞增殖； C，D：Annexin V-FITC／PI 法测定细胞凋亡； E，F：Transwell 实验检测细胞迁移； *代表与对照比较，P ＜0．05Fig．3 Effect of up-regulated miR-939 expression on the proliferation，apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

图4 ENCCs 中miR-939 靶向调控SOX4 表达 A：RT-PCR 检测SOX4 mRNA 表达； B：Western blot 检测SOX4 蛋白表达； C：Western blot 条带ImageJ 定量结果； D：通过miRWalk、Tarbase 和TargetScan 数据库预测到miR-939 靶基因； *表示与对照比较，P ＜0．05Fig．4 Up-regulated miR-939 regulated SOX4 expression in enteric neural crest stem cells

图5 下调SOX4 的表达对肠神经嵴干细胞增殖、凋亡和迁移的影响 A、B：RT-PCR 和Western blot 证实转染SOX4-siRNA 可敲低ENCCs 细胞中SOX4 的mRNA 和蛋白表达； C：CCK8 法测定细胞增殖； D：Annexin V-FITC ／ PI 法测定细胞凋亡； E：Transwell 实验检测细胞迁移； *代表与对照比较，P ＜0．05Fig．5 Effect of down-regulation of SOX4 expression on proliferation，apoptosis and migration of enteric neural crest stem cells

三、miR-939 表达上调对ENCCs 增殖、凋亡和迁移能力的影响

使用miR-939 mimic 转染ENCCs，RT-PCR 检测结果显示miR-939 的表达水平上调（图3A）。 CCK-8 实验结果表明，与对照组相比，上调miR-939 的表达显著抑制ENCCs 细胞增殖（图3B）；流式细胞仪分析表明，与对照组相比，上调miR-939 的表达显著促进ENCCs 细胞凋亡（图3C，图3D）；Transwell 实验结果表明，与对照组相比，上调miR-939 的表达显著抑制ENCCs 细胞迁移（图3E，图3F）。

四、miR-939 靶向调控ENCCs SOX4 表达水平

转染miR-939 mimic 后，分别通过RT-PCR 和Western blot 检测SOX4 的mRNA 和蛋白表达水平，结果显示，与对照组相比，转染miR-939 mimic 显著抑制ENCCs 细胞中SOX4 的表达（图4A—图4C）。在miRWalk、Tarbase 和TargetScan 数据库分别预测到miR-939 靶基因数分别为2 059 个、72 个和1 294 个，三个数据预测到的共同靶基因有8 个，其中包含SOX4，在TargetScan 获得miR-939 与SOX4结合位点信息（图4D）。

五、下调SOX4 对ENCCs 增殖、凋亡和迁移能力的影响

使用SOX4-siRNA 转染ENCCs 细胞，RT-PCR和Western blot 检测结果显示SOX4 的mRNA 和蛋白表达下调（图5A，图5B），分别检测ENCCs 细胞增殖、迁移和凋亡（方法同前），结果表明，下调SOX4 的表达可显著抑制ENCCs 细胞的增殖（图5C）和迁移（图5E），并促进凋亡（图5D）。

讨 论

肠神经系统（enteric nervous system，ENS）属于直接调节胃肠系统的独立神经系统，而肠神经嵴前体细胞（enteric neural crest cells，ENCCs）发育障碍是导致ENS 相关疾病，引发肠道功能异常的主要原因之一［23］。 当ENCCs 增殖、凋亡、迁移和分化等过程出现异常时可引起先天性巨结肠（Hirschsprung"s disease，HSCR）［24］。 HSCR 的发生是一个复杂的过程，涉及多个基因转录和表达异常，尽管很多学者已经鉴定出一些导致HSCR 发生的关键基因，但尚不清楚导致其发病机理的主要机制。

在胚胎发生过程中，ENCCs 从结肠前端到远端的迁移需要持续数周，此过程中影响ENCCs 增殖、迁移和凋亡的各种因素均可能影响神经节的形成。大量研究已证明miRNA 在胚胎发育过程中起着至关重要的作用，而关于miRNA 参与HSCR 的发病过程也有较多研究。 据报道，miR-192／215 在HSCR组织样品中显著下调，且沉默miR-192／215 通过靶向Nidogen 1（NID1）抑制人293T 和SH-SY5Y 细胞的增殖和迁移［14］。 另外，miR-206 的下调通过抑制细胞增殖和迁移而参与HSCR 的发生［12，13］。 下调miR-200a／141 通过调节磷酸酶-张力蛋白同源物的表达在HSCR 发病过程中起关键作用［25］。 此外，有学者研究报道，HSCR 患者血浆外泌体中存在异常高表达的miRNAs 分子，有可能参与细胞外基质-受体相互作用，通过干扰细胞连接而促进HSCR 发生［26］。 本研究发现miR-939 在HSCR 患者结肠组织样本中显著上调，并且上调miR-939 的表达显著抑制ENCCs 的迁移和增殖，并促进细胞凋亡。 这些结果表明miR-939 的异常高表达可能直接参与破坏ENCCs 功能的过程，从而促进先天性巨结肠的发展。

性别决定区相关高迁移率族盒蛋白4（Sry-related HMG box 4，SOX4）为SOX（Sry-related HMG box）转录因子家族成员之一，广泛参与胚胎期神经元发育、轴突形成和神经元映射，以及生殖系统发育等过程，并在多种类型的人类恶性肿瘤患者组织中呈高表达状态。 SOX4 的高表达与肿瘤血管生成以及对放化疗的抗性有关［27］。 据报道，SOX4 的上调促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭，SOX4 的高表达可抑制宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性。 SOX4可能通过Notch 信号通路调控Mash1、Ngn1 和Ngn2转录因子表达，并与SOX11 发挥协同作用调控神经发生［20］。 课题组前期研究发现，先天性巨结肠组织样本中SOX4 表达显著下调［21］，提示SOX4 可能参与HSCR 的发病过程。 基于此，本研究通过转染靶向SOX4 的siRNA 敲低ENCCs 细胞中SOX4 的表达，结果显示，下调SOX4 可显著抑制ENCCs 细胞增殖和迁移能力，促进细胞凋亡。 本研究还观察到上调miR-939 可显著抑制ENCCs 细胞中SOX4 的表达，并获得与敲低SOX4 类似ENCCs 表型变化结果。 此外，通过miRWalk、Tarbase 和TargetScan 数据库分别预测到miR-939 可能的靶基因为SOX4，在TargetScan 获得miR-939 与SOX4 结合位点信息。以上结果表明，miR-939 可能通过靶向调控SOX4 表达来影响ENCCs 细胞功能，进而参与HSCR 发生过程。

HSCR 的早期诊断和治疗是改善患者预后的关键。 然而，临床上HSCR 具有多种亚型及复杂的临床表现，钡灌肠、直肠肛门测压、家族史和基因诊断技术等均不能对HSCR 进行可靠预测，主要依赖于直肠活组织检查发现特征性神经节细胞数量的减少来做出最终诊断。 有学者［26］提到循环生物标志物对HSCR 的诊断意义，肝癌和结肠癌患者血液中miR-939 表达水平均对疾病诊断和预后具有独立预测价值，并对促炎基因表达有调控作用。 因此，有必要开展针对HSCR 患者血液循环miRNAs 的研究，为临床上通过检测血液循环miR-939 作为HSCR 诊断的辅助手段提供证据支持。

综上所述，本研究认为，miR-939 和SOX4 均参与HSCR 的发病过程。 HSCR 患者肠组织中miR-939 显著上调，而SOX4 显著下调。 上调miR-939 或下调SOX4 均可抑制ENCCs 的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。 miR-939 的高表达通过靶向抑制SOX4表达，从而抑制ENCCs 的生长、迁移和促进凋亡，从而参与HSCR 的发生发展过程。 因此，靶向miR-939 或SOX4 的干预措施可能是HSCR 临床诊断与治疗的新思路。