一株志贺氏菌分离株对肉鸡致病性试验

邓征宇

（湖南省永州市冷水滩区畜牧水产事务中心 425000）

志贺氏菌属于革兰阴性菌，在显微镜下呈杆状且观察到没有鞭毛、有菌毛，是常见肠道致病菌，其引起的细菌病是影响公共卫生的人畜共患病之一。志贺菌在到达结肠后，首先会侵入结肠上皮细胞，在细胞内复制，然后扩散到邻近细胞，最终引起强烈的炎症反应[1]。目前为止，通过不同的抗原差异将志贺氏菌分为痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌，共鉴定出约55 种血清型。在养殖业中，志贺氏菌的感染会迅速传播，如果处理不及时，会造成不可挽回的损失。

本文从感染志贺菌病的肉鸡中分离出31 株志贺氏菌分离株，通过致病性评估筛选出强致病性菌株。以强致病性菌株感染30 日龄肉鸡，建立了动物治疗模型。为后续噬菌体治疗试验建立了基础[2]。

1 材料与方法

1.1 志贺氏菌的分离纯化，致病性评估

细菌分离自感染志贺菌病的肉鸡黏膜中。刮取感染志贺氏菌的肉鸡肠道黏膜物1g，溶于10ml 无菌水中混匀，通过不同梯度稀释后取100μl 在SS （志贺菌与沙门氏菌选择性培养基）培养基进行涂布。挑取单个粉色菌落进行纯化，使用细菌DNA提取试剂盒进行DNA 提取后进行16Sr DNA 鉴定。

为了评估分离菌株的致病性，选取志贺氏菌分离株进行富集培养后以每只肉鸡终浓度约为5×107CFU 的量进行灌喂，此试验每组为5 只肉鸡，观察24h 内肉鸡的变化。

1.2 动物治疗模型建立

筛选出强致病性志贺氏菌分离株后，以1×106CFU，1×107CFU，1×108CFU 的量对30 日龄肉鸡进行灌喂感染。通过观察肉鸡的粪便、精神状态及每克粪便中志贺氏菌的含量来选取最佳细菌灌喂量。对致病性效果优异的分组，将肉鸡在不同时间进行解剖，观察肉鸡体内器官病变状况。

2 结果

2.1 志贺氏菌的分离纯化，致病性评估

从感染志贺菌病的肉鸡肠道中分离出BDS3-BDS33 共计31株志贺菌分离株，以肉鸡为动物模型进行了致病性比较试验。结果表明，志贺氏菌分离株BDS8 相较于其他分离株有更强的致病性，肉鸡在灌喂BDS8 菌液后精神萎靡，进食量减少，在2h 左右出现腹泻，且在12h 出现血便，持续至24h 也并未出现好转。筛选出BDS8 用于后续的动物治疗试验。

2.2 动物治疗模型建立

筛选出强致病性志贺氏菌分离株BDS8，以1×106CFU，1×107CFU，1×108CFU 的量对30 日龄肉鸡进行灌喂。发现灌喂1×108CFU 的量时肉鸡在2h 开始出现腹泻且精神萎靡，一直持续至24h 并未自愈。取肉鸡粪便检测发现，每克粪便中志贺氏菌的含量在2h 开始增长，在4h 左右达到顶峰，24h 后并未恢复正常水平（图1）。对感染前，感染7d，感染15d 的肉鸡进行解剖，发现感染15d 的肉鸡炎症严重，心脏肿大且被黄色心包膜包被，肠系膜出血明显（图2）。

3 讨论

在本研究中，我们从感染志贺氏菌的肉鸡中分离出了31株志贺氏菌，命名为BDS3-BDS31。之后以健康肉鸡为载体，对志贺氏菌分离株进行致病性评估，通过观察肉鸡精神状态、粪便性状筛选出强致病性志贺氏菌分离株BDS8。使用BDS8 以3 个不同的剂量进行灌喂，发现以1×108CFU 灌喂的肉鸡在感染后2h 开始出现严重腹泻，一直持续至24h。在对粪便进行微生物检测后发现在灌喂BDS8 菌液之后，粪便中志贺氏菌的含量明显上升。且在4h 到达顶峰。同时，在灌喂菌液的24h 后，粪便中的志贺氏菌含量依旧没有恢复至正常水平。在对感染0、5、15d 的肉鸡进行解剖发现，感染15d 的肉鸡心脏肿大且有炎症，肠系膜出血严重。

图1 BDS8 以108 CFU 的量灌喂后每克粪便中志贺氏菌含量变化

近些年，畜牧业发展十分迅速，其中肉鸡产量、销量都有大幅提升，同样，鸡肉消费也呈现上升趋势，2019 年中国肉鸡出栏数量已接近100 亿只[3]。对于细菌致病性的研究，能在现实生产中通过观察解剖快速判断感染的细菌种类，也是为寻找更高效的治疗方法铺桥搭路。

图2 感染肉鸡解剖图