AMETH_3452基因在拟无枝酸菌中的系统发育分析

唐标，吴静，郑华军，赵维，杨华*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021； 2.上海人类基因组研究中心，上海 201203；3.中国科学院 深圳先进技术研究院，广东 深圳 518055)

拟无枝酸菌(Amycolatopsis)大部分的菌株都是从土壤中分离，部分从海洋、沙漠、沉积物、临床样本等分离，归属于放线菌纲[1-2]、假诺卡氏菌目、假诺卡氏菌科[3-4]。近年来，该属菌种数量逐渐增加，迄今为止已有82个有效发表的典型菌种(https://lpsn.dsmz.de/genus/amycolatopsis)。该属的菌株可通过gyrB、recN和16S rDNA基因分划为多个分支[5-6]。该属菌种分为2个主要分支，东方拟无枝酸菌分支(Amycolatopsisorientalissubclade，AOS)和甲基拟无枝酸菌分支(Amycolatopsismethanolicasubclade，AMS)[5-8]。其中，AOS的菌株常被发现可以生产抗生素，例如A.orientalis生产万古霉素[9]、Amycolatopsismediterranei生产利福霉素[10-11]等。AMS的代表菌株A.methanolica是一个兼性甲基营养放线菌，未发现产生抗生素，且次级代谢物较少[8-12]。AMS中的菌种能够在45 ℃以上的条件下生长，属于嗜热放线菌[12-13]。后经过gyrB-recN-16S的串联核酸序列，将该属的35个菌种分为A～F分支[6]。然而，由于采用不同的序列及方法，获得的系统发育模式并不相同，因此，该属菌种的系统发育地位仍需进一步探究[14]。

全基因组数据目前已经被越来越多的用来分析原核细菌之间的进化关系，包括一些传统方法很难区分的放线菌[15]。基因组序列提供了更多的潜在分子标记用于系统发育。前期的研究在A.methanolica中发现了放线菌纲中普遍存在的特有基因AMETH_3452，定位在拟无枝酸菌属环形基因组的复制终点附近[8]。但是该基因的生理特征和应用前景尚不明确。

本研究对AMETH_3452基因进行了蛋白表达分析，对可能存在的保守位点进行了解析，利用AMETH_3452蛋白序列对拟无枝酸菌属内76个菌株的同源序列进行了系统发育分析，为该基因的功能解析和潜在的检测方法应用提供了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株培养和基因组抽提

菌株A.methanolica239来自本实验室保藏，使用高天琼脂培养基(20 g·L-1淀粉，0.5 g·L-1L-天冬氨酸，1 g·L-1硝酸钾，0.5 g·L-1三水合磷酸氢二钾，0.5 g·L-1氯化钠，0.5 g·L-1七水硫酸镁，1 g·L-1氯化钙和15 g·L-1琼脂粉，pH 7.5)在30 ℃条件下复苏培养2 d，随后转接至ISP2液体培养基(0.4%酵母浸出物，1%麦芽浸出物和0.4%葡萄糖)在30 ℃条件下培养2 d。使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，按照说明书提取基因组DNA。

1.2 质粒构建与蛋白表达

载体pET-28a(5.3 kb，kan+)用NdeⅠ/HindⅢ双酶切、去磷、胶回收纯化后，以A.methanolica239基因组为模板，用高保真聚合酶phanta(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行PCR扩增(F：5′-AGCCATATGGTGCGCTCCCACA GCTATGAC-3′，R：5′-CGCAAGCTTTCAGCCTTCCG GGTCGGTCAC3′)后纯化。用NdeⅠ/HindⅢ双酶切回收产物进行黏性末端连接，转化大肠杆菌DH10B菌株，37 ℃培养，筛选得到阳性转化子。将构建成功的质粒和对照质粒pET-28转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，37 ℃过夜培养后获得单克隆。接种单克隆至5 mL液体LB培养基中，30 ℃过夜培养，按1%比例转接到50 mL的LB液体培养基中，30 ℃培养至D600约为0.8时加入终浓度为0.2 mmol的IPTG，调整摇床温度至16 ℃过夜培养。离心收集菌体，超声裂解细胞，分离上清和沉淀，其中沉淀用50 mL TE缓冲液重悬，最后分别取样进行蛋白电泳。

1.3 基因与蛋白序列分析

AMETH_3452蛋白二级结构预测使用PSIPRED server[16](http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)；生理特性预测使用Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)；蛋白质跨膜区预测使用TMHMM，(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；信号肽的预测使用SignalP[17](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。AMETH_3452基因在拟无枝酸菌中的同源序列参考之前的报道[8]，对位分析使用Clustal W，去除非对位碱基后，使用BioEdit进行保守区可视化。

1.4 系统发育分析

AMETH_3452的同源蛋白序列通过在GenBank的NR库上BLAST检索直系同源蛋白，选择所有全长匹配(匹配长度>95%)的拟无枝酸菌的直系同源蛋白。使用Clustal W进行比对，通过MEGA X软件[18]基于最大似然法(Maximum-likelihood method)构建系统发育树，进化树分支模式的稳定性分析采用bootstrap法，重复次数为1 000。外类群使用Pseudonocardiadioxanivorans菌株的同源蛋白。

2 结果与分析

2.1 AMETH_3452蛋白和编码基因的序列特征

通过对18个拟无枝酸菌不同种的基因序列对比发现，该基因的全长在792～861 bp，不同的基因序列同源性在79.23%～99.02%。通过比对分析后可以看出，在300～500 bp的位置序列较为保守(图1中A)，可以作为该属的分子标记，用于核酸检测。该蛋白序列通过预测后发现不稳定系数为35.66(<40)，说明蛋白性质稳定，亲水性为-0.177，说明可溶性不好。预测到TMHs(跨膜螺旋)个数为0，即不存在跨膜区，未预测到信号肽区域。在115位氨基酸之前主要的二级结构以β-折叠为主，而在之后，α-螺旋增加(图1中B)。另外，在蛋白的75～115位预测到结构域，可能与水解酶相关。

图1 AMETH_3452蛋白二级结构预测与AMETH_3452基因保守性分析

2.2 AMETH_3452表达载体构建与蛋白表达

AMETH_3452基因扩增后，通过NdeⅠ/HindⅢ双酶切后黏性末端连接将基因序列构建在表达载体pET-28a上，形成表达质粒pTC17260，总长度为6 121 bp。AMETH_3452蛋白大小为29.2 KD，该蛋白和His标签融合表达(图2中A)。表达宿主加入IPTG诱导，裂解细菌通过蛋白电泳后发现，AMETH_3452蛋白有表达，并位于正确的可见条带上(图2中B)。在目标产物的下方，仍有较明显的蛋白条带产生，可能存在其他基因被诱导表达的情况。另外，全细胞破碎后电泳，发现表达出的蛋白以包涵体的形式富集在沉淀中，但是仍有较多存在于上清中，为后期蛋白纯化提供了有利条件。

图2 AMETH_3452蛋白表达质粒构建与表达宿主上清液蛋白电泳

2.3 AMETH_3452蛋白序列的系统发育分析

将AMETH_3452蛋白在NCBI数据库比对后发现，共检索到76条拟无枝酸菌的直系同源蛋白，与AMETH_3452的同源性均大于77.82%。聚类分析后(图3)可知，Amycolatopsiseurytherma[13]、Amycolatopsissp.ATCC 39116、Amycolatopsismethan-olica、Amycolatopsisdeserti、Amycolatopsisgranulosa、Amycolatopsisviridis、Amycolatopsisendophytica[19]菌株在同一个分支，为AMS(甲基拟无枝酸菌分支)。另外有49个菌株聚类在AOS分支(东方拟无枝酸菌分支)上。而AOS又可以分成稳定的2个分支，自展值分别是83和99，可靠性较高。其中一支命名为AMEDS(地中海拟无枝酸菌分支)，以A.mediterranei为代表，包括19个菌株；另一支为AORIS(东方拟无枝酸菌分支，属于AOS的小分支)，以A.orientalis为代表，共包括30个菌株。此外，从系统发育树的根部可以看出，Amycolatopsisarida与其他菌株距离较远。该菌株在2018年被Imen Nouioui从Yuhushielladeserti重新命名为A.arida[15]。此外从整体上看，多个种名未命名的菌株均聚类在进化树中，与已有种名的菌株序列都有差异，同样也说明该蛋白序列作为系统发育分析标记具有较强的分辨率和准确性。

图3 AMETH_3452蛋白序列在拟无枝酸菌中系统发育分析

3 讨论

16S rDNA序列广泛应用于细菌的系统发育分析，但由于部分细菌基因组中存在多个不同的16S rDNA序列拷贝，给系统发育树分支结构造成了困扰[20-21]。本文利用一个广泛存在于放线菌的具有269个氨基酸的保守蛋白AMETH_3452在拟无枝酸菌中进行了系统发育分析，得到了稳定的分支结构，与前人报道的系统发育树具有一定相似性[5,6,14]。使用该蛋白序列在AOS中将菌株聚类，可明确将其分成2个分支AMEDS和AORIS。由于该蛋白序列的获得主要依据NCBI数据库中的全基因组序列，本文采用的序列相比16S rDNA的普适性具有一定劣势，没有穷尽该属所有的菌株。

在拟无枝酸菌中，AMETH_3452基因序列保守性较高，下一步可以作为分子检测的标记应用。此外，AMETH_3452蛋白具有一定的可溶性，未来可进一步研究其生理功能。鉴于该蛋白的保守性，下一步拟通过在放线菌其他目中进行更广泛的系统发育分析，验证该蛋白作为分子标记的适用性和效果。