白玉兰根围细菌及菌根真菌遗传多样性分析

何小丽

(1.上海市园林科学规划研究院，上海 200232； 2.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232)

玉兰，为木兰目、木兰科、木兰属落叶乔木，常见种类有白玉兰、望春玉兰、二乔玉兰、紫玉兰等，为中国著名花木，是早春重要的观花树木，有着两千多年的栽培历史。玉兰喜温暖湿润气候和肥沃疏松土壤，不耐干旱和水涝，现多见于园林或行道树两侧。白玉兰为上海市市花，上海气候湿润多雨，植物根围土壤中分布着大量的微生物，根围微生物和植物互生互利，植物为根围微生物提供碳源、氮源及其他营养物质，根围微生物帮助植物更好的吸收土壤中的矿质营养并提供大量促进植物生长的激素等物质，同时由于占据有效生态位，也具有有效防御病原菌侵害等作用。根围微生物中的菌根真菌与植物关系紧密，据估计，3%的植物都会形成菌根结构[1-2]。浙江嵊州作为全国著名的玉兰繁殖基地，本研究对浙江嵊州白玉兰林进行土样采集，分析其根围细菌群落及菌根真菌多样性，为了解白玉兰根围微生物群落结构打下基础，从而为白玉兰的推广应用提供有效的科学支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

共采集浙江嵊州1～4号白玉兰林不同深度(0～30、30～60 cm)土壤样品7个，分别编号为1-30、1-60、2-30、2-60、3-30、4-30、4-60。3号样地由于土壤硬且杂质较多，只取0～30 cm土样，编号3-30(表1)。

表1 各白玉兰根围土样的理化性质

1.2 土壤微生物DNA提取及MIseq测序

称取250 mg的样品，放入灭菌的2 mL离心管中，加入1 mL 70%乙醇，震荡混匀，10 000 r·min-1室温离心3 min，弃上层液体。加入1×PBS溶液，震荡混匀，10 000 r·min-1室温离心3 min，弃上层液体。倒置2 mL离心管于吸水纸上1 min，直至没有液体流出。将样品管于55 ℃烘箱放置10 min，使残留酒精完全挥发。具体提取步骤参照OMEGA试剂盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用说明书。使用琼脂糖凝胶检测DNA完整性。

采用通用引物(341F/805R)对土样细菌16S rDNA基因的V3～V4区进行扩增，采用菌根特异性引物(AMV4.5NF/AMDGR)[3]对土样菌根真菌18S rDNA基因进行扩增。PCR扩增体系为50 μL，其中含2×Taq master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol)1 μL、Primer R(10 μmol)1 μL、Genomic DNA 10～20 ng、H2O 补齐至50 μL。PCR扩增的反应条件为：94 ℃ 3 min；5×(94 ℃ 30 s；45 ℃ 20 s；65 ℃ 30 s)；20×(94 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1∶1等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。PCR扩增产物利用上海生工生物工程有限公司的MiSeq PE300测定仪(Illumina Inc.San Diego.CA.USA)完成序列测定。

1.3 数据分析

将测序所得全部有效的基因序列以97%的一致性聚类得到OTUs序列，通过RDP classifier软件对所有OTUs序列进行序列比对得到其系统发生关系。

2 结果与分析

2.1 白玉兰林土壤细菌多样性

1～4号地块的白玉兰林土壤细菌香农多样性指数均在6左右(表2)。其中，1、2号地块不同深度土壤细菌香农多样性指数表现为表层0～30 cm高于深层30～60 cm土壤，4号地块细菌香农多样性指数表现为表层0～30 cm与深层30～60 cm土壤差异不显著。

表2 各白玉兰根围土样的细菌多样性指数与丰度

不同地块白玉兰土壤细菌物种相对含量平均值大于1%的主要为Unclassified(37.5%)、Gp2(6.1%)、Gp1(5.6%)、Gp3(2.6%)、Rhizomicrobium(2.5%)、Phenylobacterium(2.1%)、Ktedonobacter(2.1%)、Arthrobacter(1.7%)、Burkholderia(1.2%)、Gemmatimonas(1.3%)、Sphingosinicella(1.3%)、Pseudomonas(1.2%)(图1)。不同地块不同深度土壤细菌群落结构有所差异，1-30、1-60、2-30、2-60中GP2、GP1相对丰度较高；3-30优势种类Phenylobacterium相对丰度较高；4-30、4-60优势种类GP2、GP1、GP3、Rhizomicrobium相对丰富较高。上述结果可知，由于GP2、GP1、GP3等种类名称还未确定，其功能也就难以被深入研究，有待后期进一步的研究。

图1 各白玉兰根围土样细菌群落在属水平上的组成和相对丰度

2.2 白玉兰根围细菌群落环境影响因子分析

速效钾AK与第一排序轴高度相关，是白玉兰根围细菌群落主要环境影响因子，碱解氮AN、有效磷AP、有机质OM、pH和第二排序轴高度相关，为白玉兰根围细菌群落次要环境影响因子。其中1、2号地块细菌群落与pH正相关，3号地块细菌群落与AK正相关，4号地块细菌群落与OM、AN、AP和EC值正相关(图2)。

图2 白玉兰根围细菌群落与土壤理化因子的典型对应分析

2.3 白玉兰林菌根真菌多样性

1～4号地块中1-30样品土壤菌根真菌香农多样性指数最高，为4.60，高于其他6个样品(表3)。其中，1、2号地块不同深度土壤菌根真菌香农多样性指数表现为表层0～30 cm高于深层30～60 cm土壤，这与其细菌多样性指数一致；4号地块菌根真菌香农多样性指数表现为与其细菌多样性指数变化保持一致。

表3 各白玉兰根围土样的菌根真菌多样性指数与丰度

在属的分类水平上，不同地块白玉兰土壤菌根真菌物种主要为unclassified(45.9%)、Umbelopsis(19.6%)、Geminibasidium(6.0%)、Aphelidium(4.1%)、Knufia(2.4%)、Thanatephorus(2.3%)、Aspergillus(1.7%)、Venturia(1.6%)、Powellomyces(1.6%)、Fimicolochytrium(1.3%)、Xylobolus(1.2%)。不同地块不同深度土壤菌根真菌群落结构差异较大，1-30中Geminibasidium、Knufia、Rigifila占有较高比例，分别为6.0%、7.3%、5.5%；1-60中Aphelidium、Knufia、Fimicolochytrium、Xylobolus占有较高比例，分别为24.5%、8.9%、8.2%、7.0%；2-30、3-30中未分类细菌平均占80%，表明其中含大量潜在的新种；2-60中Geminibasidium、Thanatephorus、Venturia、Powellomyces占有较高比例，分别为31.9%、13.5%、8.1%和5.0%(图3)。可以看出4号白玉兰林4-30、4-60土壤中Umbelopsis为主要的优势种群，相对丰度分别占65.8%、69.3%，远高于其他5个土壤样品。

图3 各白玉兰根围土样菌根真菌群落在属水平上的组成和相对丰度

3 小结与讨论

土壤根围细菌和菌根真菌对植物生长影响显著，但由于土壤微生物及菌根真菌研究方法的局限性，园林植物根围细菌及其菌根真菌分布特征研究报道较少，且多集中在常见的花卉植物。本研究发现，浙江嵊州1～4号白玉兰林根围细菌群落结构较相似(3号林除外)。1～4号白玉兰菌根真菌群落差异较大，其中4号白玉兰林菌根真菌以Umbelopsis为主要优势菌，且与矮小伞霉菌(Umbelopsisnana)的相似度达99%。很多学者也从其他植物中分离到伞状霉属，如赵建娜[4]从兰科植物根部分离到伞状霉属等菌根真菌；罗开源[5]从锈叶杜鹃根部分离到伞状霉属真菌；杨鹤同[6]从铁皮石斛根部分离到伞状霉属真菌。研究表明，Umbelopsis并不是白玉兰的专一性菌根真菌[7-8]，通常可以将植物促生菌制备成菌剂促进植物生长[9-10]，因此，可以通过添加外源菌根真菌Umbelopsis菌剂以提高白玉兰林土壤菌根真菌含量，从而间接提升白玉兰林的生长状态。从白玉兰长势来看，4号地块白玉兰长势最佳，优于1～3号地块白玉兰。1～4号地块白玉兰土壤菌根真菌群落结构差异明显，且无共同的优势菌根真菌，只有1-60、2-60中的Aphelidium、Geminibasidium占有较高比例，分别达24.5%、31.9%；1～3号地块主要为粗放式管理的白玉兰林，人工干预小，4号地块为基地栽植，人工精细化管理，肥水措施完善，4号地块土壤肥力明显高于1～3号地块，这些综合因素可能导致4号地块与其他地块菌根真菌群落不同。综合分析表明，土壤肥力的提升对白玉兰菌根真菌遗传多样性的影响较大，但对细菌遗传多样性影响较小，可以通过改变白玉兰菌根真菌群落结构来提升白玉兰林生长效果。本研究对浙江嵊州地区白玉兰林地开展研究，研究结果为上海市白玉兰的培育与管护提供借鉴意义。对上海地区白玉兰根围细菌及其菌根真菌群落有待开展进一步对比研究。