云南边贸进口即食食品中金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

晏明兴，陈芸，吕廷保，关鼎儒，李杜慧，何俊蓉，梁微，杨玲春*，胡永金*，朱仁俊*

1(云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明，650000)2(昆明海关技术中心，云南 昆明，650000) 3(昆明海关，云南 昆明，650000)

边贸食品是指相连两国在一定的边界范围和一定金额范围内免税销售的食品，云南边贸进口食品是云南边境贸易经济中的重要组成部分，它具有食品来源广，销售和从业人员复杂等特点[1-3]。根据昆明海关调查表明，目前云南进口的边贸食品涵盖20余类300多个品种，以糖果和巧克力、糕点、果蔬干、饮料、果脯5大类加工食品和大米、玉米、冷冻动物产品等动植物源性食品为主[4]。同时云南拥有4 061公里边界线，100多个边民互市点，是我国与东南亚4国的重要交通要道。利用云南边境地区特殊的地理位置，大力发展云南边境特色经济“边贸食品”贸易，对促进我国云南边境地区城镇化发展、稳边、固边和富边有着重要的作用[5-6]。随着近年来云南边境贸易经济和边境游的快速发展，边贸进口食品安全的防控变得越来越重要，其中食源性致病菌尤为重要。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是一种广泛存在于自然界中的常见食源性致病菌[7-8]。金黄色葡萄球菌引起食物中毒的原因是其会产生多种毒素和侵袭性酶，其中金黄色葡萄球菌分泌的毒力因子主要为溶血毒素、杀白细胞素、毒性休克综合症毒素-1、肠毒素、表皮剥脱毒素、耐热核酸酶、血浆凝固酶等[9-10]。由于金黄色葡萄球菌毒性强、分布广和耐高温等特性，近年来世界各国都加强了对金黄色葡萄球菌的研究，从它的检测方法、耐药性、产毒性、分布状况以及基因层面等进行了全面研究[11-13]。

本研究从云南边贸进口即食食品出发，通过对样品中金黄色葡萄球菌进行检测和鉴定，了解云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的污染状况。并通过16S rDNA分析其遗传进化，了解9株金黄色葡萄球菌之间的同源性和遗传进化差异。为全面了解云南边贸进口食品食源性致病菌污染状况和制定云南边贸食品安全防控措施提供理论技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品来源于云南河口、瑞丽、金水河、畹町以及天保5个边境口岸城市的农贸市场、街边小贩和进口食品特色店的云南边贸进口即食食品。

金黄色葡萄球菌来源于云南边贸进口即食食品的筛选和分离。

Baird-Parker琼脂、BHI肉汤、血琼脂平板、冻干血浆、TSA琼脂，广东环凯微生物科技有限公司；GP鉴定卡、无菌盐水(质量分数为0.45%～0.50%NaCl,pH 4.5～7.0),梅里埃诊断产品(上海)有限公司。

1.2 仪器与设备

AC2-5S1生物安全柜,ESCO Airstream公司；LTI-700W恒温培养箱,东京理化器械株式会社；Vortex 2涡旋混匀仪,艾卡(广州)仪器设备有限公司；浊度计、全自动微生物鉴定系统VITEK2-compact、PREVI Color Gram全自动革兰氏染片仪,生物梅里埃；Bagmixer 400cc均质器,法国INTERSCIENCE公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验样品的采集

样品的采集方案参考GB 4789.1—2016设计[14]，随机采样于云南边境口岸城市河口、瑞丽、金水河、天保和畹町，采样地点为当地的农贸市场、街边小贩和边贸食品专卖店。采好的样品经无菌自封袋密封后，由昆明海关技术中心微生物实验室进行检验和鉴定。

1.3.2 金黄色葡萄球菌检测与分离

参照GB 4789.10—2016[15]对样品进行金黄色葡萄球菌的检验和分离鉴定。通过金黄色葡萄球菌的选择性和鉴别培养基，挑选出符合金黄色葡萄球菌典型菌落特征和显微形态的可疑菌株。

1.3.3 金黄色葡萄球菌鉴定

对筛选出的可疑菌株进行溶血试验、血浆凝固酶试验、全自动微生物生化鉴定系统和革兰氏染色试验。

1.3.4 金黄色葡萄球菌VITEK2鉴定

将可疑金黄色葡萄球菌接种于TSA琼脂培养24 h 后，通过GP鉴定卡进行全自动微生物鉴定系统VITEK2-compact的鉴定。

1.3.5 金黄色葡萄球菌16S rDNA测序鉴定

将确证过的菌株送到北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行16S rDNA测序。16S rDNA扩增引物为1492R和27F，引物序列分别为27F：(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1492R：(5′-GGC TACCTTGTTACGACTT-3′)[16]。根据刘康军等[17]、李英军等[18]、郝悦等[19]的PCR实验参数，本次研究PCR反应体系25 μL：MIX 12.5 μL，dd H2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，PCR反应条件为：95 ℃ 预变性5 min，(95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min 40 s)×34，72 ℃，5 min。对扩增产物进行测序，测序结果与NCBL数据库进行对比，进一步确证菌株。

1.3.6 构建金黄色葡萄球菌系统发育树

由1492R和27F引物扩增出的16S rDNA测序，用ContigExpress拼接测序结果。将整理好的序列用BioEdit进行格式转换，用Clustalx的Alignment对测序结果进行分析，并利用MEGA的Neighbor Joining模式构建系统发育树。

1.3.7 金黄色葡萄球菌16S rDNA序列同源性分析

分别将9株金黄色葡萄球菌的16S rDNA测序结果导入NCBI的GenBank数据库中进行比对，并从NCBI的GenBank数据库中挑选同源性高和出现频率相同的10株金黄色葡萄球菌16S rDNA和本次实验的序列进行对比，结果用MEGA的Distnce模式构建细菌之间的遗传差异性和同源性。

1.4 数据分析

通过ContigExpress、Excel、MEGA、NCBI等软件对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 云南边贸进口食品样品采集

本次实验采集的样品主要来源于东南亚的越南、缅甸、老挝和泰国4国，共采集进口边贸食品样品459份。其中越南食品257份，缅甸食品84份，老挝食品44份，泰国食品64份，其他来源食品10份。并根据采集样品所具有的共同特性，将采集好的459份边贸进口即食食品样品分为糕点及饼干、调味品、糖果与巧克力、果蔬干制品、粮食制品、坚果、饮料、水产品制品、膨化食品以及罐头制品，采样结果见表1。

表1 样品采集 单位：份

2.2 云南边贸进口即食食品中金黄色葡萄球菌的分离与鉴定结果

对459份云南边贸进口即食食品进行金黄色葡萄球菌的检测，其中2份样品检出金黄色葡萄球菌可疑菌株，并从2份阳性样品中分离出可疑黄色葡萄球菌9株，其中从泰国巧克力食品上挑选出4株并命名为SA-1、SA-2、SA-3、SA-4，从越南椰子糖上挑选出5株，并命名为SA-5、SA-6、SA-7、SA-8、SA-9。对9株可疑金黄色葡萄球菌进行鉴定，结果发现，9株可疑金黄色葡萄球菌都发生溶血性反应、血浆凝固酶反应为阳性、全自动微生物生化鉴定系统43种生化试剂生化分型鉴定结果符合金黄色葡萄球菌、VITEK2-compact鉴定阳性，同时9株金黄色葡萄球菌DNA扩增产物的分子质量在1 500 bp左右，16S rDNA鉴定为金黄色葡萄球菌，鉴定结果的置信度都在90%～100%，详细信息见表2和图1。

表2 云南边贸进口即食食品中金黄色葡萄球菌分离及鉴定Table 2 identification and isolation of Staphylococcus aureus in ready-to-eat food imported from Yunnan border trade

a-革兰氏染色;b-溶血性;c-16S rDNA电泳图图1 鉴定结果Fig.1 Identification result注：M为marker；1～9为9株金黄色葡萄球菌SA-1～SA-9

2.3 云南边贸进口即食食品中金黄色葡萄球菌污染状况

从459份云南边贸进口即食食品中的2份样品中检出金黄色葡萄球菌，总检出率为0.43%(2/459)。2份阳性样品均为糖果和巧克力，均采集于云南天保口岸，在糖果和巧克力中的检出率为3.8%。其中一份巧克力来源于泰国，其检出率为本次实验泰国食品总数的1.5%，一份越南椰子糖来源于越南，其检出率为本次实验越南食品总数的0.38%，详细信息见表3。与杨菁等[20]对2016—2018年云南省食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究中金黄色葡萄球菌总检出率为2.60%相比，本次云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的总检出率较低，但因越南和泰国进口边贸食品的样品采集总数有差异，不能进一步分析两国进口食品的污染状况。从样品种类来分析云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的污染状况，本次金黄色葡萄球菌都来源于边贸进口糖类食品。同时通过本次研究，说明云南边贸进口食品中存在一定的金黄色葡萄球菌污染风险。

表3 云南边贸进口即食食品中金黄色葡萄球菌Table 3 Staphylococcus aureus in ready-to-eat food imported from Yunnan border trade

2.4 16S rDNA测序结果分析

2.4.1 系统发育树

为了解云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的污染来源，通过16S rDNA序列来分析菌株之间的遗传进化差异，来判断菌株之间来源差异。用从云南边贸进口食品中分离的9株金黄色葡萄球菌的16S rDNA序列构建系统发育树(图2)。结果发现，9株从云南边贸进口食品中检出的金黄色葡萄球菌可分为3簇，其中SA-2、SA-7为一簇，SA-5、SA-3、SA-4为一簇，SA-6、SA-9、SA-1、SA-8为一簇。并对其遗传进化关系分析，发现9株金黄色葡萄球菌与所检出样品来源国籍无明显的遗传进化差异关系，说明9株菌株可能来源于境内食品在运输和销售过程中的二次污染。

为泰国巧克力食品上分离出的菌株；为越南椰子糖上分离出的菌株图2 九株金黄色葡萄球菌遗传进化关系Fig.2 Genetic evolution of 9 strains of Staphylococcus aureus

2.4.2 同源性分析

为了进一步了解云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的污染来源，将拼接好的9株金黄色葡萄球菌

16S rDNA序列分别与NCBI进行比对，挑选出10株相似性最高且出现频率相同的金黄色葡萄球菌菌株(NR115606.1、NR113956.1、NR036828.1、NR037007.1、NR043146.1、NR036904.1、NR027519.1、NR024665.1、NR113957.1、NR118450.1)进行同源性和遗传差异性的分析,如表5所示，结果表明，19株金黄色葡萄球菌的遗传差异为0～0.79，同源性>93%，说明9株从越南和泰国边贸进口食品中检出的金黄色葡萄球菌之间遗传差异小、同源性高，进一步说明9株菌株可能来源于境内食品在运输和销售过程中的二次污染。

表5 同源性分析Table 5 Homology analysis

3 讨论与结论

随着我国“一带一路”、西部大开发和开放力度的加大，地处我国西南边陲与东南亚3国相连的云南近年来边境贸易经济发展快速，其中具有异国特色的进口边贸食品贸易就是重要的组成部分。随着我国对进口即食食品需求的增加，人们对进口食品安全越来越关注[21]。例如，董国富等[22]在1993年就开始针对广西提出中越边境贸易中食品卫生安全状况的研究，刘本军[23]提出了“堵疏结合, 疏导为主, 严格把关, 重点帮扶”的边境食品安全监管新途径等管理政策。同时近年科研工作者已开始进行针对边贸进口食品中食源性致病菌污染状况的研究，王梦琦等[24]和何成伟等[25]均对进口食品中细菌污染状况进行了研究。

本文对云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的研究，从对样品的采集、检验、分离、鉴定，到进化同源性分析的一系列研究，保证了云南边贸进口食品中金黄色葡萄球菌的具体来源和可溯源性。同时本次实验经过GB 4789.10—2016、全自动微生物生化鉴定系统、微生物全自动鉴定仪VITEK 2-compact、16S rDNA测序多种鉴定方法同时鉴定，保障了检验结果的可靠性。

本文对云南4个边境口岸的459份进口边贸食品进行金黄色葡萄球菌检测，其中阳性食品2份，检出率占本次总样品数的0.43%、糖类食品的3.84%。经过多元识别和遗传进化关系分析，发现菌株之间不存在明显的样品来源进化差异，由此推测这些菌株的来源可能存在食品运输、贮存和销售过程中境内的二次污染。本研究为今后云南边贸进口食品多种食源性致病菌检测研究、构建云南边贸进口食品食源性致病菌溯源技术、云南边贸进口食品食源性致病菌安全预警平台和制定边贸食品食源性致病菌相关政策提供了一定的理论和技术支持。