STAT1的SUMO4修饰在高糖诱导的肾小管上皮细胞上皮-间叶性转化中的作用

谷存洋，张怡晗，刘淑霞，吴怡瑶，肖云飞，刘金熹，许 洁，王晓丹，刘青娟

糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因，约44%的DKD患者可能发展为ESRD。肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)是DKD进展到ESRD的主要病理基础，而肾近曲小管上皮细胞通过上皮-间叶性转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)转变为肌成纤维细胞是产生细胞外基质的主要细胞，在TIF进展中发挥重要作用[1]。有研究表明，DKD组织中STAT1被磷酸化激活，且STAT1的激活与TIF和EMT有关[2-3]。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是一种重要的蛋白质翻译后修饰[4]，STAT1可发生SUMO化修饰且该修饰会影响STAT1的活性[5-6]。以往关于STAT1的SUMO化修饰的研究主要集中在SUMO1、SUMO2和SUMO3，而SUMO4主要在肾脏和免疫系统中表达[7-8]。本文以人肾小管上皮细胞为分析对象，探讨STAT1的SUMO4修饰情况，以及该修饰在高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料人肾近曲小管上皮细胞株HK-2购自美国ATCC公司，兔抗SUMO4、α-SMA购自美国Abcam公司；鼠抗vimentin、p-STAT1，购自美国Abcam公司；鼠抗STAT1、兔抗E-cadherin、β-actin、A/G beads，均购自美国ProteinTech公司；报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；SUMO4与UBC9 siRNA购自上海Sangon Biotech公司；转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Thermo Scientific公司；STAT1-Luc质粒购自上海Genonmeditech公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及转染 HK-2细胞用含有10%胎牛血清与1%青链霉素混合液的DMEM培养基，在37 ℃ 5% CO2的培养箱中正常培养。待细胞融合至60%～80%时，随机分为：空白对照组，给予正常糖(NG，5.5 mmol/L葡萄糖)培养、高糖组(HG，30 mmol/L葡萄糖)、SUMO4-siRNA(转染SUMO4 siRNA)组、NC-siRNA(转染scrimble siRNA)组、UBC9-siRNA(转染UBC9 siRNA)组。用Lipofectamine 3000将20 nmol/L的SUMO4 siRNA、UBC9 siRNA与500 ng的STAT1-Luc质粒转染入HK-2细胞中，继续用高糖培养基培养，48 h后收集细胞进行Western blot、Co-IP和双荧光素酶报告基因分析。

1.2.2Western blot检测 用含0.4%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液裂解HK-2细胞，然后用BCA试剂盒对蛋白进行定量。蛋白电泳、转膜后分别用抗SUMO4、STAT1、p-STAT1、E-cadherin、vimentin、α-SMA和β-actin抗体封闭过夜。采用ECL化学发光试剂检测底物蛋白。以β-actin为内参，相对蛋白表达用Gel-Pro analyzer定量。

1.2.3免疫细胞化学检测 使用6孔板放置无菌盖玻片培养细胞，应用PV两步法检测E-cadherin和α-SMA的表达。4%多聚甲醛固定细胞30 min；0.1%Triton打孔30 min；3%H2O237 ℃孵育30 min去除内源性过氧化物酶；一抗1 ∶250稀释，4 ℃过夜；分别滴加反应增强液和增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木精复染核。光学显微镜下观察阳性信号。

1.2.4Co-IP检测 用含0.4%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液裂解HK-2细胞，然后用BCA试剂盒定量。将裂解物与鼠抗STAT1抗体(1 ∶2 000)在4 ℃摇架上孵育24 h，然后在4 ℃摇架上与蛋白A/G和琼脂糖孵育过夜。用IP洗涤缓冲液4次，加入Buffer缓冲液，提取的蛋白质在100 ℃下煮沸7 min，并用Western blot法检测SUMO4的表达。

1.2.5双荧光素酶报告基因分析 将STAT1-Luc质粒、SUMO4 siRNA或UBC9 siRNA共转染HK-2细胞，每组均同时转染海肾荧光素酶质粒以消除转染效率不同带来的差异，高糖刺激24 h后加入细胞裂解液PLB，在室温充分裂解。裂解液中首先加入LARⅡ试剂，检测萤火虫荧光素酶活性，随后立即加入Stop&Glo试剂，检测海肾荧光素酶活性。STAT1活性以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示。

2 结果

2.1 高糖对HK-2细胞表型转化的影响正常糖培养时，多数HK-2细胞呈典型的鹅卵石样排列；而高糖培养48 h，多数细胞明显拉长呈梭形(图1A)。免疫细胞化学结果显示，高糖刺激后HK-2细胞内E-cadherin阳性信号减弱，而α-SMA阳性信号增强(图1B)。Western blot结果表明，正常糖培养不影响vimentin、α-SMA和E-cadherin的表达(图1C)。高糖刺激下，与0 h相比，随刺激时间延长，HK-2细胞中vimentin、α-SMA的相对表达量逐渐增高，分别于高糖刺激24、48 h差异有统计学意义。高糖刺激12 h后E-cadherin的相对表达量有明显下调，且其表达变化呈时间依赖性(图1D、E)。

2.2 高糖对HK-2细胞中SUMO4、p-STAT1的影响HK-2细胞加入高糖刺激后，SUMO4的相对表达量增高，12 h达高峰，之后其表达量有所下降(图2A、B)。p-STAT1(Tyr701)的相对表达量在高糖刺激后持续上升，呈时间依赖性(图2C、D)，但总STAT1的表达不受高糖影响。正常糖培养不改变SUMO4和p-STAT1的表达(图2E)。

2.3 高糖对STAT1的SUMO4修饰的影响Co-IP检测HK-2细胞中STAT1的SUMO4化修饰。正常糖培养时，用STAT1抗体沉淀的蛋白中检测不到SUMO4，而高糖刺激后可见明显的SUMO4条带(图3)，说明两者在高糖条件下有明显的结合，并且转染UBC9 siRNA可明显抑制两者的结合，提示两者间的结合是STAT1发生了SUMO4修饰。

2.4 STAT1的SUMO4修饰对其转录活性的影响HK-2细胞中加入高糖刺激24 h后，STAT1的活性升高(图4)。转染SUMO4 siRNA或者UBC9 siRNA之后再给予高糖刺激，均可进一步提升STAT1的活性。

2.5 SUMO4低表达对高糖诱导HK-2细胞EMT的影响HK-2细胞中转染SUMO4 siRNA后再给予高糖刺激48 h，与NC-siRNA组相比，SUMO4-siRNA组中SUMO4的表达显著降低，提示敲低SUMO4 siRNA的效果显著(图5A、B)。与NC-siRNA组相比，SUMO4-siRNA组HK-2细胞中α-SMA表达量显著升高，而E-cadherin的表达显著降低(图5A、B)；提示敲低SUMO4可抑制HK-2细胞的表型转变。

3 讨论

DKD的主要病理改变是肾小球硬化及TIF。既往认为肾小球病变为DKD的主要病理改变，但越来越多的证据表明TIF与肾功能相关性比肾小球硬化更为密切。TIF是DKD发展为ESRD的重要病理基础，与肾小球病变相比，TIF能更好地预测肾脏疾病的进展[3]。TIF的特点是肾成纤维细胞的异常活化和细胞外基质的过量积累，而肾小管上皮细胞通过EMT转变为肌成纤维细胞是产生细胞外基质、促使TIF发生、发展的关键病理过程。肾小管上皮细胞发生EMT的特征是上皮细胞黏附分子如E-cadherin丢失，并出现肌成纤维细胞的标志物如α-SMA和vimentin等的表达。本组应用30 mmol/L的高糖刺激HK-2细胞，通过细胞形态的改变及E-cadherin的表达减少和α-SMA、vimentin的表达增加，再次验证了高糖可促使HK-2细胞发生EMT。

图1 高糖对HK-2细胞中vimentin、α-SMA、E-cadherin表达的影响：A.光镜观察高糖对HK-2细胞形态的影响；B.免疫细胞化学检测HK-2细胞中E-cadherin和α-SMA的表达，PV两步法；C.Western blot检测正常糖培养时HK-2细胞中vimentin、α-SMA、E-cadherin的表达；D.Western blot法检测高糖培养下HK-2细胞中vimentin、α-SMA、E-cadherin的表达；E.vimentin、α-SMA、E-cadherin相对表达量的统计学分析，与0 h相比，*P<0.05，**P<0.01

图2 高糖对HK-2细胞中SUMO4与p-STAT1表达的影响：A.Western blot法检测高糖培养下SUMO4的表达；B.SUMO4相对表达量的统计学分析，与0 h相比，*P<0.05，**P<0.01；C.Western blot法检测高糖培养时p-STAT1(Tyr701)及STAT1在HK-2中的表达；D.p-STAT1(Tyr701)相对表达量的统计学分析，与0 h相比 **P<0.01；E.Western blot法检测正常糖培养时SUMO4、p-STAT1(Tyr701)在HK-2中的表达

图4 双荧光素酶报告基因分析检测STAT1的转录活性：与NG组相比，*P<0.05，**P<0.01；与HG组相比，##P<0.01

文献报道STAT1的磷酸化水平与DKD或其它慢性肾脏疾病的TIF和EMT有关[2-3,9-10]。STAT1有一个特定的SUMO化识别位点 —— ΨKXE，Ψ代表大的疏水残基，K为赖氨酸，X为任意氨基酸，E为谷氨酸[11]，即STAT1可以发生SUMO化修饰，多数研究认为STAT1的SUMO化修饰通过影响STAT1的磷酸化进而影响其活性[12]，但以往的研究主要关注STAT1的SUMO1、SUMO2和SUMO3修饰。本实验检测HK-2细胞中STAT1的SUMO4修饰，结果表明：高糖可上调HK-2细胞内STAT1的SUMO4修饰。双荧光素酶报告基因结果显示，高糖可提升STAT1的转录活性，而抑制SUMO化修饰可进一步上调STAT1活性。此外，与单纯高糖组相比，细胞转染SUMO4 siRNA后再给予高糖刺激，HK-2细胞中E-cadherin的蛋白量增加，α-SMA的蛋白量降低，提示抑制STAT1的SUMO4修饰可缓解高糖诱导的EMT。

综上所述，高糖诱导HK-2细胞发生EMT的同时，亦可提升STAT1的SUMO4修饰，尽管此时STAT1的活性上调，但抑制SUMO化修饰使STAT1活性进一步上调后，高糖诱导的EMT得到缓解。上述结果提示，高糖条件下STAT1活性增强可能是一种保护因素，因高糖会同时增加STAT1的SUMO化修饰，该修饰可抑制STAT1的活性，因此STAT1活性上调不足以对抗高糖诱导的EMT。当然，高糖还能诱导其它致EMT的因素，比如TGF-β1的合成增多、STAT3的激活等[13-14]，这些都是STAT1不能发挥有效保护作用的原因。本组结果不同于文献报道的STAT1活化受抑可缓解EMT及TIF，可能的原因有以下几个方面：本实验应用SUMO4 siRNA处理会影响HK-2细胞中所有能被SUMO4修饰的蛋白，并不能特异抑制STAT1的SUMO4修饰；EMT缓解的原因也可能是其它蛋白的SUMO4修饰受抑导致的；文献报道的肾脏病变缓解时除观察到STAT1的磷酸化水平下调外，也有其它因素的变化，究竟哪些因素介导了病变的缓解尚不明确。因此，我们还需进一步特异性的靶向抑制STAT1的活性，以明确STAT1的激活在TIF中的作用。