杨梅中灭蝇胺及其代谢物检测方法与风险评估

田 培，赵慧宇，*，刘之炜，王 娇，狄珊珊，徐 浩，汪志威，王新全，4，齐沛沛

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江省农药残留检测与控制研究重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.农业农村部农药残留检测重点实验室，浙江 杭州 310021； 4.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(杭州)，浙江 杭州 310021)

杨梅是我国南方地区重要的经济作物，杨梅成熟期是果蝇盛发期，导致烂果落果，严重影响经济效益。调研和检测发现，农药灭蝇胺在生产中被用于防治果蝇[1]，一般在杨梅成熟期使用。杨梅没有果皮，很多消费者不清洗直接食用。鉴于目前杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺的残留风险尚不明确。因此，开展杨梅中灭蝇胺和三聚氰胺农药风险评估研究十分有必要。

灭蝇胺(cyromazine)又名环丙氨嗪，化学名称为N-环丙基-1， 3， 5-三嗪-2， 4， 6三胺，属于三嗪类昆虫生长调节剂，在动植物体内可通过脱烷基作用代谢为三聚氰胺。灭蝇胺亦在许多国家获准登记作为农药使用，在我国主要用于防治菜豆、黄瓜、韭菜等蔬菜上的美洲斑潜蝇和潜叶蝇[2]。康奈尔大学向美国环境保护局(EPA)递交的研究报告表明，灭蝇胺可致动物乳房产生肿瘤，其代谢产物三聚氰胺在饮食中剂量大于10 000 mg·kg-1时会导致公鼠膀胱肿瘤。为了减少环境中残留灭蝇胺对人类的潜在危害，美国、欧盟、国际法典委员会(CAC)和中国等均制定了严格的食品、畜产品和饲料中灭蝇胺的最大残留限量。很多国家也制定了灭蝇胺在水果中的最大限量值(MRL)，例如欧盟规定了水果中灭蝇胺的MRL为0.05 mg·kg-1；日本规定了水果(除杧果)中灭蝇胺的MRL为1.0 mg·kg-1，杧果中灭蝇胺的MRL为0.50 mg·kg-1；美国规定了杧果中灭蝇胺的MRL为0.50 mg·kg-1；GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了瓜果类水果(除西瓜)中灭蝇胺的MRL为0.50 mg·kg-1。2005年，康奈尔大学向纽州政府建议将灭蝇胺列为“限制使用”的化合物。

现阶段暂时没有关于杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺的国标或行业检测方法，有文献讨论研究其检测方法，大多是基于气相色谱-串联质谱、高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱等仪器检测方法的研究讨论。但是液相色谱法响应低且对于干扰物质无法进行定性分析，气相色谱-串联质谱仪法前处理步骤繁琐；高效液相色谱-串联质谱法能够很好地进行定性、定量分析。灭蝇胺及其代谢产物水溶性强，有机溶剂提取不完全，加上杨梅偏酸性，含有色素等基质干扰，为其检测方法的开发带来了挑战[3]。本研究拟建立杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺的高效液相色谱-串联质谱仪检测方法，通过优化提取溶剂，建立更为高效、快速、有效的前处理方法，并进行初步膳食风险评估，明确杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺的膳食暴露风险，为今后上述目标物的风险检测和预警提供检测方法技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验中选用的空白东魁杨梅样品来自台州市仙居县某杨梅基地，且经过检测分析不含灭蝇胺和三聚氰胺。

灭蝇胺(纯度>99.0%，德国Dr Ehrenstorfer公司)，三聚氰胺(纯度>99.0%，德国Dr Ehrenstorfer公司)，乙腈、甲醇(色谱纯，美国Merck公司)，氨水(分析纯，杭州高晶精细化工有限公司)，甲酸[色谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司]，三氯乙酸(纯度>99.0%，上海安谱实验科技股份有限公司)，MCX固相萃取小柱(60 mg，3 mL，深圳逗点生物技术有限公司)。

液相色谱-串联质谱仪(AB 4500，AB-SCIEX)，台式离心机(美国Thermo公司)，BSA2202S电子天平(北京塞多利斯科学仪器有限公司)，TTL DCII型氮吹仪(北京同泰联科技发展有限公司)，超声波振荡器(KQ 500DE，苏州昆山超声仪器有限公司)，多通道振荡器(英芮生化科技有限公司)，固相萃取仪(美国Suphlco公司)。

1.2 样品前处理

提取：准确称取5.00 g(精确到0.01 g)均质样品至50 mL塑料离心管，加入10 mL 1%三氯乙酸，充分振荡20 min；超声提取20 min后，再次加入15 mL 1%三氯乙酸，充分振荡20 min；超声提取20 min，混匀，5 439×g离心3 min，用10 mL移液管移取10 mL液体，待净化。

净化：依次用3 mL甲醇、3 mL水活化固相萃取小柱，将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水、3 mL甲醇洗涤，抽至近干，用6 mL 5%氨化甲醇分2次洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在50 ℃用氮气吹至近干，残留物用2 mL体积比9∶1的乙腈：0.1%甲酸定容，旋涡混合1 min，过微孔滤膜后，供LC-MS/MS测定。

1.3 标准溶液配制

基质匹配标准溶液配制：用空白基质提取液将化合物混标逐级稀释成浓度为0.01、0.02、0.04、0.05和0.10 mg·L-1的基质匹配标准溶液。

溶剂标准溶液配制：用体积比9∶1的乙腈：0.1%甲酸溶液将化合物混标逐级稀释成浓度为0.01、0.02、0.04、0.05和0.10 mg·L-1的溶剂标准溶液。

1.4 LC-MS/MS分析

色谱柱：Omega 1.6 μm-1.8-C18柱(Akzo Nobel公司)，2.1 mm×100 mm；流动相为A：5 mmol·L-1乙酸铵和0.1%甲酸水溶液；B：甲醇。梯度洗脱程序为0—2.0 min，60% B，2.0—6.0 min，95% B，6.0—8.0 min，95% B；8.0—8.2 min，60% B。流速为0.35 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量2 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，加热温度450 ℃，喷雾电压为正源5 500 V，负源4 500 V。目标化合物质谱参数如表1所示。

1.5 风险评估方法

本研究以检测数据为基础，采用点评估(PE)方法[4]，对我国不同人群的潜在膳食风险进行评估。

1.5.1 慢性膳食暴露风险评估方法

按照国际上普遍认可的风险评估原理和方法[4]，用公式(1)估计每日摄入量(EDI)。

(1)

式(1)中：VEDI为每日摄入量的估计值，单位为mg·kg-1·d-1；Ci为第i种食物的残留平均值，单位mg·kg-1；Fi为第i种食物的消费量，单位kg·d-1；m为体重，单位kg。

表1 目标化合物的LC-MS/MS参数

慢性摄入风险(RQc)用每日摄入量的估计值与每日允许摄入量(ADI)的比值表示，按公式(2)计算。

(2)

式(2)中：VADI为每日允许摄入量的值，单位为mg·kg-1·d-1；VRQc为慢性风险商的值。

1.5.2 急性膳食暴露风险评估方法

采用公式(3)估计短期摄入量(ESTI)[4]。

(3)

式(3)中：VESTI为短期摄入量的估计值，单位mg·kg-1·d-1；VHR为采用食物的最大残留值，单位mg·kg-1；VLPperson为食物的大份餐消费量，单位kg·person-1·d-1；m为体重，单位kg。

急性摄入风险用短期摄入量的估计值与急性参考剂量(ARfD)的比值表示，按公式(4)计算。

(4)

式(4)中：VARfD为急性参考剂量的值，单位为mg·kg-1·d-1。VRQa为急性风险商的值。当VRQa≤1时，表示风险可接受，VRQa越小风险越小；当VRQa>1时，表示风险不可接受，VRQa越大风险越大。

1.6 数据来源

根据文献[5-6]的报道，灭蝇胺的ARfD为0.10 mg·kg-1·d-1，三聚氰胺的ARfD为2.40 mg·kg-1·d-1。GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》规定：灭蝇胺的ADI为0.06 mg·kg-1·d-1；三聚氰胺的ADI为0.20 mg·kg-1·d-1，ARfD为2.40 mg·kg-1·d-1[7]。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的优化

灭蝇胺和三聚氰胺的酸度系数(Pka)分别为7.5[8]和8.0[9]。为了保证待测物在含有苯酸基团的MCX固相萃取柱上得到较好的保留，提取液pH应低于待测物酸度系数(Pka)值2个单位。因此，本研究通过加入三氯乙酸溶液调节萃取液的pH，以保证基质中目标物在MCX固相萃取柱中可以保留。分别比较了1%三氯乙酸、1%三氯乙酸-乙腈(3+2)、乙酸铵-乙腈(1+4)、乙腈作为提取溶液时灭蝇胺和三聚氰胺的回收率，结果表明：1%三氯乙酸作为提取溶剂能够获得良好的回收率(表2)，故选择了1%三氯乙酸作为提取溶剂。

2.2 方法学评价

2.2.1 方法的线性范围、相关性与基质效应

配制0.01、0.02、0.04、0.05、0.10 mg·L-1的三聚氰胺和灭蝇胺标准溶液，分别进样。以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，分别得到三聚氰胺和灭蝇胺的线性方程(表3)。三聚氰胺和灭蝇胺在0.01～0.10 mg·L-1线性良好，决定系数R2均大于0.99。

2.2.2 基质效应

农药残留检测过程中基质效应是影响定量准确度的关键因素之一。根据配制的溶剂标和基质标线性方程，采用基质标线性方程斜率/溶剂标方程斜率来评价基质效应，斜率之比<1认为是基质抑制效应，若斜率之比>1认为是基质增强效应。杨梅富含糖分和色素，根据表中溶剂标线性方程斜率和基质标方程斜率可知，杨梅中灭蝇胺和三聚氰胺均为基质抑制效应。该结果与鸡蛋中灭蝇胺和三聚氰胺的残留呈现基质增强效应[10]的结论不同，主要原因是两者基质组成差异造成，鸡蛋中富蛋白质，而杨梅中富含糖分和色素。因此，检测杨梅中灭蝇胺和三聚氰胺残留时应配制相应的基质匹配标准溶液进行定量分析。

表2 不同提取溶液对灭蝇胺和三聚氰胺的提取效率

表3 灭蝇胺和三聚氰胺的线性方程、决定系数、检出限、定量限

2.2.3 回收率和精密度

以不含灭蝇胺和三聚氰胺的杨梅作为空白基质，按在空白基质中添加标准溶液的方法进行回收率和精密度测定，设置4个浓度梯度，分别为0.05、0.10、0.20、0.40 mg·kg-1，分别平行测定5次。测定结果(表4)表明，样品中灭蝇胺和三聚氰胺的添加回收率分别为77.6%～90.8%和71.6%～84.7%，相对标准偏差均小于10%。

该实验中灭蝇胺和三聚氰胺经1%三氯乙酸溶液提取，用MCX固相萃取柱净化，然后用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪测定，通过外标法定量。灭蝇胺和三聚氰胺方法的检出限均为0.01 mg·kg-1，方法的定量限均为0.05 mg·kg-1。根据欧盟规定的水果中灭蝇胺的MRL(0.05 mg·kg-1)和日本规定的水果(除杧果)中灭蝇胺的MRL(1.0 mg·kg-1)，本方法的检出限完全满足水果中对灭蝇胺的风险筛查需求。该方法简便、快速、高效，且能够满足杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺的定性和定量分析要求。

2.3 膳食风险评估结果

本研究采集了来自浙江台州市、金华市、温州市、杭州市、绍兴市、宁波市、舟山市、丽水市等8地的市场和生产环节杨梅样品，共计212批次，样品量大可以覆盖杨梅大部分的主产县级市，可真实反映浙江省杨梅主产区的农药残留现状。

表4 灭蝇胺和三聚氰胺在杨梅中的添加回收率与相对标准偏差(n=5)

2.3.1 灭蝇胺和三聚氰胺在杨梅中的分布

212批次杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺残留检出率分别为2.4%和21.7%，其残留中值分别为0.05 mg·kg-1和0.02 mg·kg-1，最大残留值分别为0.13 mg·kg-1和0.08 mg·kg-1(表5)。该检测结果与生产实际用药情况相符。

2.3.2 农药的慢性膳食暴露风险评估

评估计算涉及未检出农药残留的样品，其残留量按定量限(LOD)计算。根据澳大利亚和新西兰等国家公布的风险评估计算方法[11]，在进行膳食暴露风险评估时，慢性风险评估可以根据评估目的使用检出的平均值、中值或最大值，通常对于农药残留风险评估使用中位数残留量而不是算术平均值，主要原因是农药残留分布通常为左偏分布而非正态分布[12]。因此，本研究采用每种农药的残留中值而不是平均值计算慢性膳食暴露风险，以避免高估风险。

为了研究所选2种农药的慢性膳食摄入风险，ADI值采用我国GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》中该农药的推荐值进行计算；其中，杨梅中的农药残留量以检测所得残留中值计算。根据表6可知，灭蝇胺和三聚氰胺的慢性风险商分别为0.001 2和0.000 1，表明杨梅中这2种农药的膳食风险较低，说明杨梅不是上述农药的主要慢性膳食风险来源。

2.3.3 农药的急性膳食暴露风险

在评估杨梅中农药残留的急性膳食风险时，由于缺乏我国人群的杨梅膳食消费数据，通过问卷调研方式统计了一般人群对杨梅的膳食大份餐消费量，并采用各农药残留检出量的最大值进行急性膳食暴露风险评估。结果表明：灭蝇胺和三聚氰胺的膳食急性风险商分别为0.024和0.006，说明正常情况下吃杨梅不会对人群产生健康风险。

表5 杨梅中农药残留检出情况

表6 杨梅中农药残留膳食暴露风险评估

3 结论与讨论

本研究建立了固相萃取结合LC-MS/MS方法测定杨梅中灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺，该方法前处理简便、经济、高效，可以用于今后该目标物在杨梅中的残留检测。由于灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺均易溶于水，其萃取方法一直是分析的难点问题。Yu等[9]利用高压液相萃取的方法解决这一萃取困难问题，然而特殊的仪器设备和复杂的萃取步骤大大影响了分析效率。Wang等[13]采用QuEChERS方法，使用乙腈萃取了鸡蛋中灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺，并获得了较好的回收率，然而鸡蛋中的含水量低，因此，该方法不能适用于含水量高的水果萃取。

由于灭蝇胺在杨梅上未获得登记，因此，灭蝇胺及其代谢物三聚氰胺的膳食暴露风险需要进一步评估。在评估杨梅中农药灭蝇胺和三聚氰胺的慢性风险时，残留量采用了212批次杨梅中灭蝇胺和三聚氰胺的检出值，未检出样品的残留量均取其定量限值，因此，保守地估计了灭蝇胺及其代谢产物三聚氰胺的慢性膳食摄入风险。成人每日杨梅消费量为7.5 g，大份餐消费量为1 144 g；成人平均体重采用我国限量标准编制时使用的63 kg。由于近年来中国居民的身体条件实际已发生了一些变化，该体重数据与真实情况可能存在偏差。另外，由于目前我国缺乏官方统计的杨梅膳食消费数据，本研究采用了问卷调研的杨梅消费量数据，问卷量和统计人群代表性有待进一步评价，该数据已是目前能够获取到的最接近杨梅真实消费情况的统计数据。考虑到急性和慢性风险评估结果显示风险很低，因此，上述不确定因素带来的评估结果误差不会影响最终结论。