PVA/PAAm水凝胶人工血管材料及其血液相容性

邢美毅，王欣悦，王 璐，关国平

(东华大学 a. 纺织学院；b. 纺织面料技术教育部重点实验室，上海 201620)

心血管疾病每年造成全球死亡人数高达1 730万人，其中因冠状动脉阻塞造成的死亡占50%[1]，冠状动脉搭桥术是治疗严重缺血性疾病的有效手段[2-3]。目前临床应用的小口径(直径<6 mm)血管仍以自体移植物为主[4]。但自体血管来源不足、血管尺寸不匹配以及原有疾病的限制，迫切需要研发替代品[5]。此外，存在现有的小口径人工血管产品易诱发血栓、通畅率低，与天然血管的力学性能不匹配，影响移植物远期通畅率[6-8]等问题，适用于冠状动脉搭桥的小口径人工血管产品不多。因此，开发综合性能优良的小口径人工血管仍是该领域研究的热点和难点。

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)水凝胶是一种具有高强度、高弹性的医用水凝胶，已被广泛应用于生物医学研究领域[8-9]。聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAAm)水凝胶具有生物惰性和结构稳定性，其生物相容性好，在体内移植物、药物控制释放等生物医学领域得到应用[10-11]。因此，开发具有互穿网络结构的PVA/PAAm水凝胶，有望获得综合性能更好的生物医用水凝胶材料。本研究设计并编织了一种PET管道，以增强PVA/PAAm水凝胶人工血管材料的力学性能，并系统表征了其与血液的相容性。

1 材料与方法

1.1 试剂

PVA，丙烯酰胺(acrylamide, AAm)，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，过硫酸铵(APS)，N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，磷酸二氢钾(KH2PO4)，氯化钙(CaCl2)，无水乙醇，戊二醛，多聚甲醛。

1.2 方法

1.2.1 编织管的设计成型

本研究选择直径为0.25 mm的涤纶单丝在32锭编织机上编织增强管，使用直径为4 mm聚四氟乙烯管作为内撑管，编织角分别为60°、65°和70°。编织管的管径变化率[12]计算如式(1)所示。

(1)

式中:R为管径变化率，%；D1和D2分别为编织管拉伸前和伸长率为50%时的管内径，mm。

1.2.2 编织管增强的小口径水凝胶人工血管的制备

根据文献[13]中的方法，先将PVA和AAm按照5∶8的质量比在去离子水中混合成均匀的溶液。利用一次性注射器将混合溶液缓慢浇注至组装好的管状模具中，得到管状预凝胶(若制备增强水凝胶人工血管需要先将涤纶编织管固定于模具中)。然后使管状凝胶在室温下干燥并在真空干燥箱中退火，80 ℃下3 h，120 ℃下1 h。将干凝胶浸泡在去离子水中达到吸水平衡以获得小口径水凝胶人工血管(hydrogel vascular graft, HVG)和编织管增强的小口径水凝胶人工血管(reinforced hydrogel vascular graft, RHVG)。这两种人工血管采用文献[14]中优化后的水凝胶材料制备，即PVA与PAAm质量比为5∶8的水凝胶。

1.2.3 HVG和RHVG的拉伸性能

根据标准ISO 7198: 2016，使用YG(B)026G-500型单轴向拉伸强力仪对HVG和RHVG进行轴向定伸长拉伸强度和周向拉伸断裂强度测试。轴向拉伸定伸长率为50%，试样的长度为70 mm，隔距为50 mm，拉伸速度为50 mm/min，样本重复数n=3。定伸长停留时间为5 s。采用直径为3 mm的血管周向拉伸夹头，试样长度为20 mm，拉伸速度为50 mm/min，样本重复数n=3。试验后计算并取平均值。

1.2.4 缝合线固位强力

根据ISO 7198: 2016，使用YG(B)026G-500型单轴向拉伸强力仪对HVG和RHVG进行缝合线固位强力测试。试样长度为20 mm，隔距为15 mm，试样重复测试数n=3，试验后计算平均值。试验时，将试样一端固定于夹具的下夹头，另一端在距边缘2 mm的位置，被5-0带针缝合线穿过后，将缝合线固定于上夹头。上夹头以50 mm/min的速度匀速运动，向上拉伸缝合线直到试样破裂。

1.2.5 径向顺应性

动脉顺应性[15]是血管壁的内在弹性特性。顺应性不匹配易在人工血管内形成血栓，并导致吻合口内膜异常增生。故本研究采用BioDynamic Test Instrument (BOSE公司)平台对HVG、RHVG及商用e-PTFE管进行径向动态顺应性测试。样本重复测试数n=3，结果取平均值。其中，水流流速为100 mL/min，频率为1 Hz，测试压强分别为6.65～11.97 kPa(50～90 mmHg)、10.64～15.96 kPa(80～120 mmHg)、14.63～19.95 kPa(110～150 mmHg)。按照式(2)计算径向顺应性[16]。

(2)

式中：C为顺应性，%/13.3 kPa；Rp1、Rp2和R分别表示低压、高压和不加压时对应的试样外半径值，mm；p1和p2分别为低压和高压值，kPa。

1.2.6 溶血试验

血样取自健康新西兰大白兔耳动脉，通过多次洗涤抗凝全血并离心后得到沉淀的红细胞。将红细胞与磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶34比例混合均匀得到富含红细胞的溶液(red blood cells, RBC)。RBC用于测试RHVG的溶血性能，并与PVA水凝胶和PAAm水凝胶的溶血性能进行对比。将3种材料切成1 cm3的试样，用去离子水将其充分洗涤干净，自然风干表面后，用体积分数为75%的酒精蒸汽灭菌12 h。试验时，需将3种试样分别浸泡在1 mL RBC和4 mL PBS的混合溶液中，并在37 ℃的恒温箱中孵育2 h后，再于5 000 r/min条件下对溶液离心5 min，用酶标仪测定上清液在540 nm处的吸光度。阳性对照组为1 mL RBC和4 mL去离子水的混合溶液，阴性对照组为1 mL RBC和4 mL PBS的混合溶液。溶血率(H)按照式(3)计算[17-18]。

(3)

式中：H为溶血率，%；Dt、Dnc和Dpc分别为试样、阴性对照组和阳性对照组的吸光度。

1.2.7 凝血试验

将PVA、PAAm和RHVG 3种水凝胶剪成直径为14 mm、厚度为3 mm的圆形试样置于24孔板中。取载玻片作为阳性对照组。每个孔中加入100 μL全血和20 μL的CaCl2溶液(0.2 mol/L)。试样在37 ℃条件下，分别孵育5、10、30、60 min后取出。每孔中再加入2.5 mL去离子水，继续在37 ℃下孵育5 min。将上清液取出，置于离心管中振荡混匀，在室温下静置15 min后，测试上清液的吸光度为540 nm。凝血指数(B)[19]计算如式(4)所示。

(4)

式中：It为试样的吸光度；Iw为2.5 mL去离子水加100 μL全血所得混合溶液的吸光度值。

1.2.8 血小板黏附试验

参照文献[20]中的试验方法，将含有抗凝剂的全血在1 500 r/min的条件下离心10 min，取上下两层中间的薄弱层，获得富含血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)。将3种试样分别裁剪成直径为14 mm的圆片，厚度为3 mm，置于24孔板内。将500 μL PRP滴加在试样表面，37 ℃静置2 h后用生理盐水浸洗3次，并用PBS清洗3次，每次5 min。再用1 mL 体积分数为2%的戊二醛溶液固定黏附在材料表面的血小板，室温下固定24 h。然后，依次用体积分数分别为55%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精溶液进行梯度脱水(加入1 mL酒精溶液，脱水时间为5 min)。试样冷冻干燥后运用SEM观察血小板在材料表面的黏附情况。

1.2.9 全血凝固试验

参照血小板黏附试验操作，将试样置于24孔板中，加入1 mL的PBS浸润试样，置于37 ℃摇床中，静置2 h。取0.2 mL含有凝血剂的全血置于24孔板中的试样上，静置于37 ℃的摇床中1 h。然后，取出24孔板，用PBS对试样进行轻柔清洗，重复3次。试样经清洗后，每孔加入1 mL体积分数为2.5%的戊二醛溶液，置于4 ℃冰箱中，进行固定12 h。再依次用体积分数分别为50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精溶液进行梯度脱水(加入3 mL酒精溶液，脱水时间为5 min)。脱水后的试样经冷冻干燥后进行SEM观察。

1.2.10 血浆复钙试验

将3种试样分别裁剪成1 cm2的小块，置于24孔板的孔中，试样重复数为3。空白孔作为对照组。向试验组和对照组的每孔中分别滴加500 μL贫血小板血浆，在37 ℃下100 r/min振荡1 h，之后将血浆转移至96孔板中。每个试样取3次。试验组每孔加入100 μL的CaCl2溶液(0.1 mol/L)，对照组每孔加入100 μL的PBS。用酶标仪测定405 nm波长处的吸光度值。每30 s测1次吸光度，连测45 min后获得血浆复钙动力学曲线[21]。

1.3 统计分析

2 结果与讨论

2.1 编织管的管径变化率

不同编织角的涤纶编织管的管径变化率如表1所示。由表1可知，当编织角为(65.0±0.5)°时，编织管的管径变化率与HVG的最为接近。为了最大限度地保证二者在形变过程中的同步性、避免RHVG在拉伸过程中的两相分离。最终选择编织角为(65.0±0.5 )°、内径为4 mm、长度为9 cm的涤纶编织管作为增强体。

表1 编织角对管径变化率的影响

2.2 编织管、HVG和RHVG的外观形态

编织管、HVG和RHVG的外观形态如图1所示。由图1可知，HVG与RHVG结构均匀、表面光滑，编织管结构规整、孔径均匀。RHVG的内径为3 mm， 外直径为5 mm，编织管直径约为4 mm。

(a) HVG

(b) 编织管

(c) RHVG

2.3 拉伸性能

HVG和RHVG的周向拉伸应力-应变曲线如图2所示。由图2可知，RHVG的断裂应力明显比HVG更高，但断裂应变不如HVG。这表明编织管的复合显著增强了水凝胶的径向拉伸应力，但限制了其伸长。但是，二者的断裂应变仍然都在600%以上，说明HVG与RHVG都具有良好的径向弹性。

图2 HVG和RHVG的周向拉伸断裂应力-应变曲线Fig.2 Stress-strain curves of circumferential tensile breaking of the HVG and the RHVG

HVG和RHVG在轴向拉伸应变为50%时的拉伸应力如图3所示。由图3可知，HVG和RHVG的轴向拉伸应力分别为(79.29±5.25) 和(273.28±15.08) kPa，而对照材料猪颈总动脉拉伸应力约为176 kPa[12]。因此，编织管不仅明显增强了HVG的力学性能，而且表明RHVG的轴向拉伸性能足以满足临床移植要求。

图3 HVG和RHVG的轴向拉伸应力 (*, P<0.05)Fig.3 The axial tensile stress of the HVG and the RHVG (*, P<0.05)

2.4 缝合线固位强力

HVG和RHVG的缝合线固位强力测试结果如图4所示。RHVG的缝合线固位强力为(8.65±0.33) N，明显高于HVG的缝合线固位强力(3.74±0.41) N。该结果表明，编织管提高了水凝胶的缝合线固位强力。临床上使用的血管移植物的缝合线固位强力的最低要求不得低于1 N[22]，说明本研究制备的RHVG能够满足临床的缝合要求。

图4 HVG和RHVG的缝合线固位强力 (*, P<0.05)Fig.4 Suture retention forces of the HVG and the RHVG (*, P<0.05)

图5 HVG、RHVG和商用e-PTFE人工血管的径向顺应性 (*, P<0.05)Fig.5 Radial compliance of the HVG, the RHVG and the commercial e-PTFE vascular prosthesis (*, P<0.05)

2.5 径向顺应性

HVG、RHVG和商用e-PTFE人工血管的径向顺应性测试结果如图5所示。在各测试压强范围下，RHVG的径向顺应性都比商用的e-PTFE人工血管的高，但低于HVG。由此表明，水凝胶用作人工血管材料，在提高径向顺应性方面具有显著的优势。编织管的复合可明显提高水凝胶人工血管材料的力学性能，包括轴向和周向抗拉伸性能和缝合线固位强力，但是限制了HVG的自由变形，导致伸长率和顺应性降低。在人体正常血压范围下，RHVG的顺应性也达到了(4.58±0.76)%/13.3 kPa，最高为(4.82±0.57)%/13.3 kPa，非常接近天然血管的顺应性值，更是商用e-PTFE人工血管的5.1倍。力学性能测试结果均表明，本研究制备的RHVG的力学性能优异，能够满足临床移植的力学要求。

2.6 溶血试验

溶血试验是材料与血红细胞接触时对红细胞的破坏作用。材料的血液相容性越好，溶血率越小。PVA、RHVG、PAAm试样的溶血率测试结果如表2所示。由表2可以看出，3种试样的溶血率均小于ASTM F 76-08标准中的2%，说明三者均具有良好的血液相容性。

表2 3种试样的溶血率Table 2 Hemolysis rate of three samples

2.7 凝血试验

根据凝血指数的计算式可知，凝血指数高，表明材料具有更好的血液相容性。PVA、RHVG和PAAm 3种试样的凝血指数与时间的关系如图6所示。由图6可知，每个时间点3种试样的凝血指数均高于对照材料，由此表明3种试样的抗凝血性能都好于对照材料。在相同的试验条件下，对照材料的凝血时间明显较短，60 min后，对照材料的凝血指数低至0.071，而其他3种试样的凝血指数均大于0.3,仍能维持较高的抗凝血能力。试样的凝血反应开始前5 min，血液凝固主要是由于添加了促凝剂Ca2+。从第10 min开始，3种试样的凝血反应逐渐饱和，凝血指数在60 min内保持稳定，表明三者在试验期间均表现出良好的抗凝性能。

图6 试样的凝血试验结果 (***, P<0.001)Fig.6 Anticoagulation test results of the samples (***, P<0.001)

2.8 血小板黏附试验

血小板的黏附与变形能够激活凝血因子，促使纤维蛋白的形成，进而形成血栓而凝血，因此，表面血小板的黏附是材料抗凝血性能的重要标志之一。PVA、PAAm和RHVG 3种试样表面血小板黏附试验结果如图7所示。由图7可知，PVA和PAAm水凝胶表面可以看到明显的血小板黏附，而在RHVG表面上几乎看不到血小板黏附。这说明PVA与PAAm的混合改变了RHVG的表面结构和化学性质，使血小板的黏附较少。

2.9 全血凝固试验

PVA、PAAm和RHVG 3种试样表面全血凝固试验结果如图8所示。由图8可知：PVA水凝胶表面黏附了较多的红细胞，并且呈聚集的状态；PAAm水凝胶表面同样黏附了较多数量的红细胞，但大多以分散的状态黏附在水凝胶表面；在RHVG表面，仅可见极少的红细胞黏附。试验结果表明，RHVG表面对于红细胞的黏附具有一定的抑制作用，从而有利于延长全血凝固时间。据文献[23]研究，制备RHVG的PVA/PAAm水凝胶实际上是一种互穿网络结构的水凝胶，其表面结构和化学性能不同于PVA水凝胶和PAAm水凝胶。

(a) PVA

(b) PAAm

(c) RHVG

(a) PVA

(b) PAAm

(c) RHVG

2.10 血浆复钙时间

血浆复钙曲线是表征血液内源性凝血的方法，血浆复钙时间是指去钙血浆加入钙源后凝固所需的时间[24]。因此，血浆复钙时间越长就说明血液凝固所需时间更长。对于生物材料，血浆复钙时间越长就意味着材料具有一定的抗凝性能。PVA、RHVG和PAAm 3种试样与阴性对照样的血浆复钙动力学曲线如图9所示。由图9可知，与PVA和PAAm水凝胶相比，RHVG的凝血时间发生右移，凝血时间延长。这表明RHVG的抗凝血性能更好。与前述其他凝血相关试验的结果一致。

图9 试样的血浆复钙时间Fig.9 Plasma recalcification time of the samples

3 结 论

为了进一步提高水凝胶人工血管材料的力学性能，本研究设计并编织了一种PET管道，利用自主设计的管道器官浇注成型模具，制备了编织管增强的水凝胶人工血管材料，并对其力学性能进行了全面的考察，同时进行了系统的血液相容性表征。研究表明，PET编织管增强的PVA与PAAm的质量比5∶8水凝胶人工血管材料具有优异的力学性能和血液相容性，尤其其径向动态顺应性达到了现有商用e-PTFE人工血管的5.1倍，体现了水凝胶材料在人工血管研究方面的巨大优势和潜力，其力学性能可以满足临床移植要求，为进一步开展动物体内试验奠定了坚实的基础。