牛巴贝斯虫病诊断技术研究进展

张 峰，王正荣，蒋建军，薄新文，张艳艳

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832000)

牛巴贝斯虫病是一种由巴贝斯虫属(Babesia)原虫所引起的血液寄生虫病，主要通过硬蜱在人与动物之间传播[1]。自1888年首次在牛的红细胞内发现双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)以来，迄今为止已经发现有100余种巴贝斯虫，其中对牛危害最大的主要是牛巴贝斯虫(B.bovis)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、分歧巴贝斯虫(B.divergens)[2-3]。牛巴贝斯虫病作为一种世界性动物寄生虫病，在热带及亚热带地区发生较为严重，常成地方季节性流行。其流行范围之所以如此广泛，与其传播媒介硬蜱密切相关[4]。硬蜱是巴贝斯虫的主要传播媒介，硬蜱科中微小牛蜱(Boophilusmicroplus)、环形牛蜱 (B.annulatus)、篦子硬蜱(Ixodesricinus)、全沟硬蜱(I.persulcatus)、镰形扇头蜱(Rhipicephalushaemaphysaloides)、外翻扇头蜱(R.evertsi)等均可传播巴贝斯虫[5]。牛巴贝斯虫病的临床特征主要以高热稽留、贫血、精神沉郁、厌食、脱水以及血红蛋白尿，严重时可引起动物体的死亡[6]。神经症状是由于牛巴贝斯虫(B.bovis)感染的红细胞存留于大脑毛细血管中而产生的，且牛巴贝斯虫的持续性感染可能会持续终生[7]。此外，分歧巴贝斯虫(B.divergens)作为一种人畜共患病，具有重要的意义。

目前已经有不同的技术来诊断牛巴贝斯虫病，通常首选姬姆萨染色法，显微镜下显示寄生虫的存在作为临床症状的病因。血清学试验包括了间接荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody test，IFAT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫层析试验(immunochromatography est，ICT)、补体结合试验(complement fixation test，CFT)等，这些试验提供了体液免疫应答的信息，可通过抗原或抗体来诊断牛巴贝斯虫病。近些年来，由于PCR技术已经逐渐成熟，用以检测血液中巴贝斯虫DNA的分子方法具有很高的灵敏度和特异性，已被证明是进行流行病学调查的有力工具。

1 血涂片检测

血涂片是检测血液中寄生虫最简单直接的方法。寄生虫的检测可以通过姬姆萨染色的血涂片来完成，但染色涂片的敏感度较低，因此经常观察到假阴性[8]。更重要的是，血涂片检测只能观察到急性期感染的红细胞。在感染初期或者慢性感染时，血液染虫率较低，不利于虫体的检测。通过显微镜对于急性感染期的牛巴贝斯虫病进行镜检，结果发现，牛巴贝斯虫(B.bovis)的红细胞染虫率低于0.5%，双芽巴贝斯虫(B.bigemina)的红细胞感染率在3%左右[9]，分歧巴贝斯虫(B.divergens)的红细胞感染率可达35%～40%[6]。牛巴贝斯虫的持续性感染可能会持续终生，而双芽巴贝斯虫感染动物后可持续长达22个月。

用姬姆萨染色的血涂片，可以通过高倍镜检测寄生虫。对于感染病牛耳廓或尾部的毛细血管进行采血时，通过血涂片可以检测到牛巴贝斯虫(B.bovis)；而通过静脉采血可以检测到双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和分歧巴贝斯虫(B.divergens)[10]。对于分歧巴贝斯虫(B.divergens)，薄涂片是观察该寄生虫的首选方法。在形态学上，分歧巴贝斯虫(B.divergens)的大小为1.5 μm～1.9 μm，属于小型虫体，虫体典型形状为成对的梨籽形；分歧巴贝斯虫病通常发展迅速，寄生虫血症在5%～80%不等，所以该寄生虫很容易用光学显微镜检测出来[11]。双芽巴贝斯虫(B.bigemina)大小为2.3 μm～5 μm，虫体长度大于红细胞，属于大型虫体，呈成对梨籽状，两虫体尖端成锐角并位于红细胞中央，每个红细胞虫体数目在1个～2个。牛巴贝斯虫(B.bovis)大小为1.5 μm～2 μm，虫体长度小于红细胞半径，属于小型虫体；虫体典型形状为成对的梨籽形，尖端相连呈钝角且位于红细胞中央，虫体常为空泡状。

尸检时宜采集脑、肾、心肌、肝、肺组织标本。在感染牛巴贝斯虫的动物中，外周血液中的红细胞染虫率较低，一般不超过1%；然而，在脑组织的涂片中红细胞染虫率高达90%[12]。这是由于感染的红细胞明显隔离在脑、肾和肾上腺的微血管床上，特别是在脾切除的动物身上。通过枕孔获得的小脑样本已被用于对长期感染牛巴贝斯虫(B.bovis)的显微镜检测[13]。

2 血清学检测

在巴贝斯虫病流行区饲养的牛中，血液中的寄生虫数量非常低，低于镜检技术的阈值。因此，血清学方法如间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和补体结合试验(CFT)常被使用。但是这些技术的主要缺点在于高抗体滴度并不一定能证明寄生虫感染的存在，也不一定能证明保护性免疫的存在。当使用血清学分析时，不能够有效地区分感染的时间(以前还是现在)。因为抗体可能持续的时间很长，即使是在巴贝斯虫被清除的动物体内[14]。

2.1 间接荧光抗体试验

间接荧光抗体试验(indirect fluorescence antibody test，IFAT)结合了荧光显微镜的高灵敏度和免疫学方法的特异性，得到了十分广泛的应用。早在1964年的时候，曾被报道用于驽巴贝斯的检测。IFAT提供了足够的灵敏度，而且易于操作。但是结果易受操作者主观判断的影响，只能定性检测。最重要的一点是，在牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)抗体之间存在交叉反应，大大降低了IFAT的特异性[15]。Nayel M等[16]曾利用血涂片、IFAT和PCR三种方法对于随机抽取的158头不同年龄、性别和品种的牛进行巴贝斯虫病和泰勒虫病的调查和诊断，结果显示，血涂片的巴贝斯虫阳性率为10.76%(17头)，泰勒虫阳性率为20.9%(33头)；IFAT对于巴贝斯虫和泰勒虫的阳性率分别是15.82%(25头)和20.89%(30头)；PCR对巴贝斯虫和泰勒虫的检测阳性率分别为12.66%(20头)和24.05%(38头)。经统计学方法处理，IFAT和PCR无显著差异，且血涂片可用于急性感染，IFAT和PCR也可应用于慢性感染。

2.2 酶联免疫吸附试验

在所有血清学的诊断方法中，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)是最有前途的诊断工具。它不仅在于能批量检测样品，不存在主观判断的差异，而且特异性也比IFAT有了很大的提高。最初从感染红细胞的裂殖子裂解物中提取粗制抗原，但是常常造成不同虫种的交叉反应，造成大量的假阳性[17-18]。

目前建立了基于血清抗体抑制单克隆抗体(mAb)结合能力的竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)。以纯化的重组牛巴贝斯虫(B.bovis)RAP-1C端构建物作为抗原，检测血清抗体对单克隆抗体与RAP-1特异性表位结合的抑制作用，用以检测阳性牛[17]，这避免了与双芽巴贝斯虫(B.bigemina)的牛血清发生交叉反应。同样的，也可以用双芽巴贝斯虫(B.bigemina)的RAP-1C端构建物作为抗原来检测阳性牛。使用该方法在患病率为75%的地区进行检测时，其阳性预测值和阴性预测值分别为100%和95.9%。这不仅能用于早期感染的检测，也适用于长期携带阶段的检测。

此外，还有一种嵌合多抗原的间接ELISA方法，该多抗原由牛巴贝斯虫(B.bovis)抗原MSA-2c、RAP-1和热休克蛋白20的B表位和T表位基因片段组成，且敏感度和特异度分别为95.9%和94.3%[19]。总之，正是因为ELISA的简便性和客观性，且能同时检测大量样本，已取代IFAT成为诊断实验室首选的血清学检测方法。

2.3 补体结合试验

补体结合试验(complement fixation test，CFT)是将抗原抗体结合物与补体结合，通过补体的消耗现象来检测出抗体或抗原的试验。CFT反应依赖于补体固定抗体的存在，其中大多数重要的同型抗体是IgM免疫球蛋白。因此，可以检测到早期感染，但不适合检测慢性感染的动物[20]。通过野外采集的牛血样本，在不同的研究中对于ELISA和CFT进行了比较。虽然两种检测方法都能检测和鉴定牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)，但是与CFT相比，IFAT具有抗体检测早、简单、经济、耗时短等优点[21]。此外，Alvarez J A等[22]还将CFT与与ELISA和IFAT进行了比较，结果具有很高的一致性，其CFT的敏感性和特异性分别为90.9%和97.6%。因此CFT检测被认为是一种敏感、经济、简便的检测方法，适用于流行病学调查。

2.4 免疫层析法

血清学检测通常存在着资源设备、训练有素的试验人员、工作量大以及耗时等问题。而免疫层析法(immunochromatography，ICT)的出现和发展在一定程度上解决了这些问题。ICT是一种基于硝酸纤维素膜的免疫分析方法，不需要任何仪器，快速、灵敏。此外，它可直接在牧场进行现场检测，且在15 min内就可以出结果[23]。

以牛巴贝斯虫(B.bovis)重组裂殖子表面抗原(RMSA-2c)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)相关蛋白-1(rRAP1/CT)的C端部分为基础，建立了检测感染牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)抗体的ICT方法。与ELISA和IFAT比较，ICT检测牛巴贝斯虫(B.bovis)抗体的一致性分别为92.3%和90.3%；而检测双芽巴贝斯虫(B.bigemina)抗体的一致性分别为96.8%和92.5%，且未见交叉反应[24]。

在另一项研究中显示，使用ICT分别检测牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)的抗体，并将野外采集的牛血样本进行双重ICT检测时，与ELISA相比，Kappa系数>0.7[25]。

3 分子生物学检测

血清学检测的方法只适用于特定寄生虫抗体的存在，然而抗体的产生需要一个过程，且又会消失，无法检测感染初期以及免疫耐过的动物。随着分子生物学的发展，基于PCR技术检测血液中巴贝斯虫DNA的分子方法具有很高的灵敏度和特异性，近些年来，针对牛巴贝斯虫棒状体相关蛋白-1 (BbovRAP-1)、牛巴贝斯虫球体蛋白-2 (BboSBP-2)、牛巴贝斯虫球体蛋白-4(BboSBP-4)、双芽巴贝斯虫顶膜抗原-1 (BbiAMA-1)和双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白-1a(BbiRAP-1a)的巢式PCR分析已被证明是进行流行病学调查的有力工具[26-29]。分子生物学诊断技术由于具有高度的敏感性、特异性和快速等特点，给巴贝斯虫的诊断和鉴别提供了快速有效的工具。

3.1 聚合酶链反应

由于外周血液中寄生虫数量很少，很难检测到巴贝斯虫感染。因此，以DNA为基础的分子方法便发展起来，它具有分析灵敏度高、特异性高等优点。其中之一便是聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，它是利用DNA双链在高温时解旋变成单链，温度低时引物与单链碱基互补配对，随后温度升至72℃，DNA聚合酶沿5′至3′形成互补链，循环多次，使得目的基因扩增。PCR检测与体外培养寄生虫相比，它更快速，具有较高的灵敏度和特异性，通过对扩增片段测序来确认该检测的特异性。而PCR检测的缺点在于PCR的设置和运行需要技术技能，可能存在污染风险，并且设备、耗材和试剂的成本较高等。

双芽巴贝斯虫(B.bigemina)第一个被用于PCR分析，目前已存在不同形式的PCR。PCR-DNA分析与非放射性DNA探针相结合，能够灵敏地检测出双芽巴贝斯虫(B.bigemina)。灵敏度分析显示，检测到低至100 fg的寄生虫基因组DNA，可用于无症状携带者动物的检测。在牛巴贝斯虫(B.bovis)中，可通过以细胞色素B为目的基因进行PCR，灵敏度约为每0.5 mL血液中就有一个被感染的红细胞，且对牛巴贝斯虫(B.bovis)具有很高的特异性[30]。此外，PCR的特异性基因检测可用于鉴定不同地理区域梨形虫的种类。当使用多重PCR来检测同一血液样品中的双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛巴贝斯虫(B.bovis)时，其分析灵敏度均为0.000 01%。

3.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与常规PCR法相比，它无需凝胶电泳的可视化，具有快速、自动扩增、低交叉污染等优点。为了检测和测量目标DNA的数量，必须产生一个信号，该信号与实时放大产物的数量成正比。在RT-qPCR中，与传统PCR相比，整个检测需要更少的模板材料。但其缺点在于设备过于昂贵，开发化验需要更高的专业知识和技术技能。

此外，RT-qPCR具有较高的灵敏度、特异性和重复性，这些特点有利于将其用于持续感染动物的诊断和量化。通过使用RT-qPCR检测，在血液样本中检测到的巴贝斯虫感染浓度比标准PCR检测低1 000倍[31]。Okino C H等人[32]证实，RT-qPCR比直接镜检更能从犊牛体中检测到牛巴贝斯虫(B.bovis) (准确率分别为100%和10%)。目前，RT-qPCR的研究已经显示出更高的敏感性和特异性，且变异更小，为患病牛巴贝斯虫的检测提供了极好的有效性和可靠性。

3.3 环介导等温扩增法

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal Amplification，LAMP)是在2000年一位日本学者Notomi公开的一种新的基因诊断技术。它是对其靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右) 保温30 min～60 min，即可完成核酸扩增反应，是一种快速、廉价、高度灵敏和特异的检测方法，且检测成本远低于荧光定量PCR。该技术在2004年成功用于吉布森巴贝斯虫的检测，随后成功应用于犬巴贝斯虫的检测。LAMP亦可用于检测双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛巴贝斯虫(B.bovis)，且对于两种巴贝斯虫的分析敏感度均为0.1pg DNA[33]。Iseki H等[34]建立了多重环介导等温扩增(multiplex loop-mediated isothermal amplification，mLAMP)方法，设计了牛巴贝斯虫(B.bovis)和双芽巴贝斯虫(B.bigemina)相关蛋白-1基因的引物，并在引物中插入一个限制性内切酶切位点，将8个总引物组合起来，建立了同时检测双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛巴贝斯虫(B.bovis)的mLAMP方法。

通过对LAMP技术进行改进，去除了凝胶电泳，用色谱横向流动试纸(LAMP-LFP)的方法，能够更简单、快速的观察到结果。LAMP-LFP包括一组的4个引物和在等温条件下扩增巴贝斯虫细胞色素b基因的6个不同区域。该方法可分别检测到0.85fg和0.14fg的双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛巴贝斯虫(B.bovis)，其分析灵敏度是常规PCR方法的100倍。LAMP-LFP可用于检测寄生虫感染量非常低的动物[35]。LAMP被认为是一种简单的诊断方法，不需要特殊设备，速度快，不易污染。该方法可用于现场大量样品的筛选。因此，它作为牛巴贝斯虫病分子诊断工具具有广阔的应用前景。

4 其他检测方法

通过异种诊断也可以检测到感染动物中寄生虫的存在。将感染巴贝斯虫的血液分别接种至脾切除的犊牛来分离双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛巴贝斯虫(B.bovis)，或接种至沙鼠身上以分离分歧巴贝斯虫(B.divergens)。蒙古沙鼠(Merionesunguiculatus)是感染分歧巴贝斯虫(B.divergens)的优良实验动物模型，在感染分歧巴贝斯虫(B.divergens)后，表现出急性症状且能引起宿主死亡[15]。但是动物接种不适合用于诊断的目的，因为它所花费的时间较长。但是通过异种诊断，在接种后的某个时间点进行分子检测，可能是一个更准确可靠的方法，因为即使在寄生虫血症非常低的情况下，也可以检测出活的寄生虫和DNA。

Claudia K等[36]曾报道了一种基于牛巴贝斯虫(B.bovis)感染红细胞阻抗谱的高分辨率、高特异性细胞检测和分离的微流控装置。因为白细胞或血小板的介电特性与感染红细胞的介电特性不同，所以不需要提前对全血样进行任何处理。虽然该生物传感器在检测1%以上的寄生虫时也存在一定的局限性，该设备已被提出用于制备正常的和感染牛巴贝斯虫(B.bovis)的红细胞群体。

流式细胞术是另一种技术，它可以分析宿主红细胞中分歧巴贝斯虫(B.divergens)的不同发育阶段，并对寄生虫血症的变化进行量化。此外，利用荧光活化细胞分选仪也可分离并克隆牛巴贝斯虫(B.bovis)，以便研究这些寄生虫种群的毒力表型。

5 小结

畜牧业作为我国传统产业和基础产业，是我国农业经济的一大支柱产业。牛巴贝斯虫病对畜牧业的危害极大，严重损害了我国农业经济的发展，因此可靠、便利的诊断方法是有效防控该病的关键。目前对于牛巴贝斯虫病的诊断已取得了一定的进展，论文重点介绍了光学显微镜的直接检测，对感染动物进行特异性抗体检测的血清学技术，基于常规PCR原理所产生的一系列高灵敏度、高特异性分子检测技术，以及虽然繁琐耗时，但可用于合适实验室条件的牛巴贝斯虫体外培养技术。这些诊断技术各有特点，虽然因为仪器与技术的原因，大部分诊断方法可能仅限于实验室，具有一定的局限性，但是仍具有着广阔的发展前景。随着诊断技术的不断完善，更加简便有效的诊断方法将会产生，牛巴贝斯虫病会得到更为有效的控制，甚至消灭。