沙门氏菌和大肠埃希氏菌耐药基因qnrS研究进展

赵 月，王湘如，彭 忠，崔潞晴，冯家伟，郭凯旋，曹征征，张 凡，戴梦红

(华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心，湖北武汉 430070)

喹诺酮类药物是一类人工合成的抗菌药物，随着药物的过量使用，细菌耐药性问题日益严重。五肽重复蛋白(pentapeptide repeat protein,Qnr)是质粒介导的喹诺酮类耐药基因(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)家族之一，携带qnr决定子的微生物更容易对喹诺酮类药物产生抗性。从许多不同种属的微生物中发现这种qnr决定子和qnr变异体，主要为弧菌科、肠杆菌科、气单胞菌科和假单胞菌科。沙门氏菌和大肠埃希氏菌均属于肠杆菌科，大肠埃希氏菌是人和动物肠道中最重要且数量最多的一种细菌，可作为耐药基因的储存库。qnrS是最广泛的PMQR基因。国内外有很多关于qnrS基因在沙门氏菌中流行的报道。qnrS也是家禽粪便中耐喹诺酮类大肠埃希氏菌的优势基因。由qnrS基因引起的喹诺酮类耐药水平与其表达水平直接相关，当qnrS基因存在于高表达环境中时，可能一步产生遗传稳定的临床耐药性[1]。qnrS基因在沙门氏菌和大肠埃希氏菌中高度流行并在对喹诺酮类耐药中扮演重要角色。本文就qnrS基因的发现、表达调控及在沙门氏菌和大肠埃希氏菌中的研究进展进行综述，为控制qnrS基因介导的耐药性提供参考。

1 qnrS基因及其变异体的发现

最早的Qnr 蛋白在1998 年发现于美国阿拉巴马州分离的一株肺炎克雷伯菌[2]，其pMG252质粒中存在一个可转移喹诺酮类耐药机制(transferable mechanisms of quinolone resistance,TMQR)蛋白，命名为Qnr蛋白。qnrS于2005年在从日本用左氧氟沙星治疗的病人中分离的一株福氏志贺氏菌2b中被发现[3]，该基因位于47 kb的接合性质粒pAH0376中。通过质粒图谱和抗药性编码基因的克隆，在pAH0376上发现了一个657 bp编码218个氨基酸多肽的开放阅读框(open reading frame,ORF)，该ORF编码的蛋白与Qnr蛋白高度相似，并且可以认为该新基因的产物是Qnr的同系物，因此把该基因及其产物命名为qnrS和QnrS。尽管qnr基因被命名为“质粒介导的”，但也存在于一些细菌的染色体上。2007年，在灿烂弧菌[3]中观察到染色体qnr，与当时描述的qnrS1和qnrS2蛋白的同源性均达到了83%以上。此后，在其他弧菌中也检测到与qnrS具有较高同源性的序列。如与Mytil弧菌(GenBank登录号KIN11186.1)和副溶血性弧菌(GenBank登录号WP-1和WP-1)的染色体qnr序列相比，分别具有97%和95.5%～96%的氨基酸同源性。迄今为止，在NCBI基因存储库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene-family:(qnrS))中记录了多达14个qnrS等位基因(qnrS1，qnrS2，qnrS4～qnrS15)。根据当前报道，qnrS基因及其变异体更多的是在质粒上被发现，在来源于S.flexneri的IncN和ColRNAI质粒[5]上发现了qnrS1；在来源于E.coli的IncX1质粒上发现了qnrS1[6]和qnrS2[7]；并且有研究证明qnrS2基因所处的遗传环境有IS26元件[8]，在来源于E.coli的IncI1质粒上发现了qnrS13[9]。由不同的质粒携带的qnrS基因在质粒DNA结构上具有相似或不同的遗传环境，qnrS基因被插入序列(insertion sequence,IS)元件包围或者位于高度移动性质粒上时有助于其转移。然而，qnrS基因是如何产生及其产生的机制还未见报道。

2 qnrS基因的表达及其调控

qnrS基因的表达依赖于喹诺酮类药物的应激，且受σ-D调控因子(regulator of sigma D,Rsd)的调控。将气单胞菌中携带qnrS2 基因的IncU型质粒pAC3导入大肠埃希氏菌中，从而研究qnrS2 基因在大肠埃希氏菌中的表达以及调控qnrS2 基因表达的机制[10]。当携带pAC3质粒的大肠埃希氏菌受到喹诺酮类药物压力时，qnrS2的表达增加，σ-D调控因子(regulator of sigma D,Rsd)的表达也有所上调，这提示Rsd可能与qnrS2基因的表达有关。敲除Rsd基因的大肠埃希氏菌在喹诺酮类药物作用下，qnrS2基因的表达明显降低，这些结果表明了Rsd通过调节qnrS2的表达在抗性中发挥作用。qnrS基因的表达受喹诺酮类药物浓度的影响[11-12]。在亚MIC浓度的环丙沙星作用下，qnrS基因的保护作用不依赖于质粒的拷贝数，而是受基因表达水平的影响，这个表达水平由环丙沙星的浓度所决定，在0.4 μg/mL环丙沙星作用下相对qnrS基因表达显著升高。另外，当环丙沙星和左氧氟沙星的浓度在0.4×MIC时，qnrS的转录量最大。

3 qnrS基因在沙门氏菌中的研究

3.1 qnrS基因在沙门氏菌中的流行

qnrS基因在沙门氏菌中高度流行。据报道，从中国26个省、自治区、直辖市腹泻猪[13]、肉鸡供应链[14]，韩国鸡源[15]和南非医院病房[16]中分离的质粒介导喹诺酮类耐药沙门氏菌中，qnrS的分离率分别为47.1%、41.1%、33.3%和19.4%。有研究报道了从腹泻患者、动物性食品和宠物中分离的多重耐药沙门氏菌中发现，几乎所有的分离株都携带qnrS基因[17]。除了以上在人食用动物、宠物、动物性食品以及环境等样品中检测到携带qnrS基因的沙门氏菌的报道外，2010年-2012年从陕西省12个地区(包括西安、宝鸡、杨凌、咸阳等)的51家超市和32家零售店随机收集干奶粉相关的婴儿食品中，也分离出携带喹诺酮类耐药基因qnrS的沙门氏菌，且阳性率高达47.5%[17]。可见，携带qnrS基因的沙门氏菌无处不在，对公共卫生和食品安全造成很大的威胁。

3.2 沙门氏菌中qnrS基因的转移

携带耐药基因的质粒能够在菌群中进行转移，引起耐药基因在菌群中的广泛传播，从而导致耐药情况加重。在英国的一项研究中[19]，不仅在沙门氏菌中检测到qnrS基因，而且还发现在4种不同血清型沙门氏菌(S.stanley,S.typhimurium,S.virchowandS.virginia)的不同质粒骨架上均存在qnrS1。根据质粒RFLP图谱显示，qnrS1位于不同的遗传环境中，但是其存在于拥有共同祖先的质粒上，这表明质粒或qnrS1在沙门氏菌菌种间的成功传播。研究发现，将沙门氏菌中携带qnrS1基因的 IncH1/IncF型质粒转移至大肠埃希氏菌J53，导致环丙沙星对大肠埃希氏菌的MIC降低2倍(1 μg/mL降至0.5 μg/mL)，但是，当该质粒转移至对环丙沙星敏感的鼠伤寒沙门氏菌(MIC为0.015 μg/mL)时，环丙沙星对沙门氏菌的MIC提高了66.67倍(1 μg/mL)，使沙门氏菌达到临床耐药水平[20]。qnrS基因在菌株之间进行传播的机制，取决于其所存在的质粒类型。qnrS基因位于接合性质粒上时，在菌株间可直接发生接合转移；qnrS基因位于非接合性质粒上时，需要一个新的Incl1型接合性辅助质粒的参与，接合性辅助质粒通过复制转录靶向位于非接合性环丙沙星耐药编码质粒中的插入序列(insertion sequence,IS)元件，最终形成可在肠杆菌科成员间传播的杂交接合质粒，从而使qnrS基因在菌株之间进行传播。此外，研究还发现只有在37℃和42℃的温度下，才会形成融合质粒，导致其随后传播至其他细菌，这表明这些质粒融合和传播事件可能发生在人和动物身上。因此，应充分了解影响qnrS基因表达上调和促进qnrS基因在菌群中转移的因素，从而为防止qnrS基因介导的耐药性的产生和传播提供参考。

4 qnrS基因在大肠埃希氏菌中的研究

4.1 qnrS基因在大肠埃希氏菌中的流行

大肠埃希氏菌是一种广泛存在于食物、环境和肠道中的微生物。据报道，从熟食品、环境、动物肠道分离的大肠埃希氏菌中均有qnrS基因的检出。qnrS基因是猪场环境中大肠埃希氏菌对喹诺酮类耐药基因中最常见的耐药基因之一。从我国3个猪场[21]采集不同样本，调查耐药大肠埃希氏菌中qnrS基因流行情况的结果显示，qnrS基因的分离率达40.00%～43.48%。在散养猪[22]中，qnrS基因具有17.9%的检出率。qnrS基因也是家禽粪便中耐喹诺酮类大肠埃希氏菌的优势基因。含qnrS基因的耐喹诺酮类药物的大肠埃希氏菌在肉鸡中非常普遍，印度尼西亚苏卡布米[23]禽大肠杆菌病临床病例中，质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrS的阳性率为23%。此外，qnrS基因还在山羊、水貂、牛等动物分离的大肠埃希氏菌中被检出。在分离出携带qnrS基因的大肠埃希氏菌的动物中，有的为健康动物[24]，这是由于其所处的圈舍卫生状况较差而获得qnrS基因。综上所述，健康的动物可以充当耐药大肠埃希氏菌的储存库，大肠埃希氏菌可作为传播qnrS基因的载体，进而使病原菌获得耐药基因产生耐药性，导致临床治疗失败。

4.2 大肠埃希氏菌中qnrS基因的转移

qnrS基因在家禽养殖场及其环境中的传播与水平基因转移和克隆传播有关，但以水平传播为主。在实验室条件下证明qnrS基因可以在不同菌种之间进行转移，即大肠埃希氏菌中的qnrS基因能够向鼠伤寒沙门氏菌进行转移[25]。qnrS基因也可以在相同菌种[26]之间进行转移，研究表明在高于耐药折点的环丙沙星(5 μg/mL)选择压力下，耐环丙沙星的大肠埃希氏菌中qnrS基因向敏感的大肠埃希氏菌中转移的同时，导致了转移接合子中gyrA喹诺酮类耐药决定区(quinolone resistance determining region,QRDR)获得性突变Ser83Leu和Asp87Asn，从而使接合子获得对喹诺酮类药物更高的耐药水平。因此，慎用抗生素是减少突变，降低耐药基因传播风险的途径。目前，在体外条件下，qnrS基因在菌种间的转移已有报道，但还未见其在动物体内环境下转移的报道。然而，在未暴露于环丙沙星的大肠埃希氏菌中，仍然可以检测到qnrS基因。研究发现，从加拿大新不伦瑞克省8个农场的荷斯坦奶牛犊牛中分离的100株头孢类耐药大肠埃希氏菌中有9株对萘啶酸耐药，同时对环丙沙星中介敏感。其中有7株检测出质粒介导的喹诺酮类耐药(2株检出qnrS)。经调查这些奶牛场主要是采用头孢噻呋治疗牛疾病，并未使用过环丙沙星[27]。这可能是因为qnrS基因与β-内酰胺类抗性基因位于同一个质粒上。近年来，已经有很多关于大肠埃希氏菌携带的qnrS与β-内酰胺类抗性基因发生共转移的报道。由此可见，大肠埃希氏菌中qnrS基因的传播会促进多重耐药性的发展。

5 展望

qnrS基因被IS元件包围的遗传环境有助于其通过质粒转移在菌株间进行传播，处于亚抑制浓度喹诺酮类药物的环境下，能够上调qnrS基因的表达，进一步降低菌株对药物的敏感性。qnrS基因在自然条件和喹诺酮类药物的选择性压力下都能够在细菌属内和属间进行转移。因此，qnrS基因引起的耐药性问题不容忽视，喹诺酮类药物的不合理使用和耐药基因qnrS的可转移性对耐药性的产生和传播带来的风险，也需要引起重视。考虑到人畜传播的可能性以及携带qnrS基因的质粒常常携带其他耐药基因，所以，要加强对临床来源菌株qnrS基因的监测，警惕该基因的传播和多重耐药性的发展。