有机污染物芘胁迫下白菜生理特性变化规律

杜志伟,杨肖松, 刘月仙,*,解小凡,张瑞丽,张 萌,王 伟

1 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 100049 2 中国矿业大学化学(北京)与环境工程学院, 北京 100083 3 煤炭开采水资源保护与利用国家重点实验室，北京 102211 4 农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一类具有两个或两个以上苯环的芳香烃,其中有16 种被美国环保署确定为优先控制的有机污染物质[1],是典型的持久性有机污染物,具有潜在致癌性、致突变性和毒性的特点[2],近几十年来备受关注。PAHs主要由不完全燃烧的过程形成,如化石燃料燃烧、生物质燃烧和石油泄漏等[3]。多环芳烃释放到环境中后,可通过干湿大气沉降和直接空气-土壤交换的方式沉积到土壤中[4],土壤作为重要的环境介质,承担着90%以上的PAHs环境负荷[5]。近些年来,土壤污染问题日益严重,对人体健康以及生态环境都造成了一定的威胁,根据全国2005- 2013年全国土壤污染普查结果显示,我国部分地区土壤污染严重,全国现有近1/5耕地受到不同程度的污染,多环芳烃类有机物污染点位超标率为1.4%[6]。与低分子量PAHs(≤ 3个苯环)相比,高分子量PAHs(≥4个苯环)更难被降解而在土壤环境中长期存在[7]。而芘是有4个苯环结构的多环芳烃,与PAHs有良好的相关性,是高分子量多环芳烃的典型代表,常作为监测的指示化合物[7- 8]。Peng等[9]测得北京土壤中的芘浓度范围在6.9—1560.8 μg/kg,平均值为127.3 μg/kg；朱媛媛等[10]对天津市土壤的多环芳烃进行分析,芘含量在12.5—183 μg/kg之间；李静雅等[11]在长江三角洲区域11个行政市测定表层土壤中16种优控PAHs浓度范围10.1—3058.6 μg/kg。

目前,已有不少针对多环芳烃对不同植物生长影响的研究,不同植物对有机污染物的毒性响应具有明显差异[12]。较高浓度的PAHs对植物生长具有抑制作用,高浓度多环芳烃胁迫下的拟南芥(Arabidopsisthaliana)、辣椒(CapsicumannuumL.)、小麦(Triticumacstivnm)、白菜(Brassicapekimensis)、西红柿(Solanumlycopersicum)、玉米(ZeamaysL.)和红豆(Vignaangularis)都出现了生长受抑制的现象[13]；蔡顺香[14]研究发现:50—200 mg/kg施芘水平下菠菜幼苗叶片的各项叶绿体色素含量与对照无显著差异,施芘浓度大于50 mg/kg时株高、根和茎叶的鲜重显著降低,且丙二醛积累量提高；而Maliszewska-Kordybach等[15]研究发现,玉米、燕麦等作物在低于10 mg/L的PAHs质量浓度的土壤中时,具有刺激其生长发育的作用。白菜是我国主要种植的蔬菜,也是大量食用的蔬菜,目前针对不同品种的白菜在多环芳烃胁迫下的生理特征研究较少,以华北地区常见的11种白菜为研究对象,探究有机污染物芘对白菜的生理指标影响具有重要意义,旨在为PAHs对植物的毒害机理研究和蔬菜的安全生产提供一定的理论依据。

1 研究材料和方法

1.1 实验材料

选取我国华北地区常见的11个不同品种的白菜作为实验对象：京翠60(JC- 60),京秋65(JQ- 65),京春娃2号(JCW- 2),京春白(JCB),京翠70(JC- 70),京春绿(JCL),北京桔红二号(JH- 2),中白50(ZB- 50),吉红308(JH- 308),菊心(JX)和快菜1号(KC- 1),均购自北京市农林科学院京研益农种业科技有限公司和中国农业科学院蔬菜花卉研究所。芘(>95%,GC)购自上海阿拉丁生化股份有限公司。

实验土壤取自北京市怀柔区中国科学院大学后山,自然风干后挑出碎石枝叶过3 mm筛,储存备用。实验土壤有机质含量为5%,pH为8.42；土壤中芘的浓度为0.09 mg/kg,根据相关文献[16],土壤中的芘含量<0.4 mg/kg时,可以忽略不记。

1.2 实验设计

根据杨肖松等[7]进行的芘对白菜生长预实验,设置5、15、45、135、405 mg/kg以及对照组共六个芘浓度处理水平。土壤毒性配置方法参照孙铁珩[17]推荐的方法,具体为：称取35 g芘于适量的丙酮中溶解,加入到10 kg的土壤中,即芘浓度为3500 mg/kg的土壤,置于通风橱中过夜,待丙酮完全挥发后搅拌均匀。在上述土壤中分别加入不同质量且未被芘污染的土壤,进行稀释搅拌,配置成不同处理浓度的土壤。分别称取六种芘处理浓度的土壤各7 kg于高18 cm、上口径为23 cm、下口径为21 cm的花盆中。为了确保白菜有足够的养分进行正常的生长,每个花盆中加入氮(CO(NH2)2)、磷(KH2PO4)、钾(KCl)肥各2.24、3.07、0.32 g,同时浇水至田间持水量平衡一周。白菜种子需预先进行消毒处理,在75%酒精中浸泡5 min后,用蒸馏水洗净,再置于55°C的水中搅拌浸泡。

将11种白菜种子在每个花盆中播种15粒,置于温室中培养,平均低温24℃,平均高温32℃。待长出四片真叶后,每盆中留一株白菜幼苗,每个品种进行3次重复。白菜从播种到成熟收获共历时80 d。

1.3 实验方法

(1)生物量(鲜重)的测定

白菜整株收获后用自来水冲洗掉表面的土及灰尘,再用去离子水冲洗三遍,滤纸擦干表面水分后,用天秤称取植株的重量。

(2)丙二醛(MDA)的测定

丙二醛的含量采用植物MDA检测试剂盒(TBA比色法)测定,购自北京雷根生物科技有限公司。具体步骤为称取0.4 g样品剪碎后,加入4 mL组织匀浆液充分研磨,经4000 r/min离心10 min,取1 mL上清液,先后分别加入0.005 mL抗氧化剂、TBA工作液,测定其在450、532、600 nm处的吸光度值。

(2)叶绿素的测定

叶绿素a和叶绿素b的含量测定根据Gitelson等[18]采用的方法,称取待测白菜叶片0.1 g置于研钵中,加入少量95%乙醇和少量的CaCO3,研磨成白色匀浆,过滤至25 mL比色管中,用95%的乙醇定容后,于波长665、649、470 nm处测定吸光度值。

1.4 数据处理及分析

采用Excel 2016、SPSS 24.0 进行数据处理和多因素方差分析,采用最小显著性差异法(LSD,P<0.05)进行多重比较；利用Origin 2018进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 生物量(鲜重)

白菜的生物量在不同浓度芘作用下以及不同种类之间的双因素方差分析表明,白菜的种类和芘浓度均对生物量有显著影响(P<0.001),且白菜种类和芘浓度存在交互作用。表1显示的是11种白菜生物量在不同浓度芘作用下的变化情况,总体呈现两种规律：一是倒“U”型,二是随着芘浓度的增加,白菜生物量降低。其中,京春娃2号、京春白、京翠70、京春绿、北京桔红二号、中白50、吉红308、菊心、快菜1号这9种白菜品种的生物量随着芘浓度的增加呈现出先升高后降低的趋势,即倒“U”型。与对照组相比,9种白菜在中低浓度芘胁迫下,快菜一号的生物量变化最大,在添加芘浓度为45 mg/kg时,生物量显著升高了178.62%,而品种京翠70是这9种白菜品种变化最小的,在添加芘浓度为15 mg/kg时生物量仅升高16.12%,其他7种白菜生物量上升的变化范围为17.57%—158.40%。京翠60、京秋65这两种白菜品种的生物量随着芘浓度升高而逐渐降低；其中,在405 mg/kg芘浓度的胁迫下生物量显著降低,京翠60的生物量降低率(59.25%)高于京秋65生物量降低率(47.96%)。

2.2 丙二醛(MDA)

根据双因素方差分析,不同白菜品种的丙二醛(MDA)含量存在显著性差异(P<0.001)。丙二醛是反映植物脂质过氧化程度的指标,是生物膜系统脂质过氧化的产物,能够间接的反映植物在受到外界的胁迫时,细胞的受损程度,MDA含量越大,膜受损程度越大[19]。如图1所示,华北地区11种白菜在不同浓度土壤芘胁迫下的MDA含量呈现出不同的变化规律：一是不同浓度芘胁迫下,白菜MDA含量无显著性变化,以京春娃、京春白和中白50这3种白菜品种为代表,与对照组相比,京春娃的MDA下降率最高(26.35%),京春白上升率最高(19.9%)；二是白菜MDA含量随芘浓度的增加而呈上升趋势,如京翠60、京秋65、吉红308和快菜一号这四种白菜品种,与对照相比,MDA含量升高率为0.18%—98.13%,且在高浓度405 mg/kg芘处理时,MDA含量显著性升高。三是白菜MDA含量在不同芘胁迫下均低于对照组,如京翠70、京春绿和北京桔红二号这3个白菜品种的MDA在低浓度芘胁迫时(5 mg/kg)显著降低,降低率分别为25.72%、60.38%、26.8%；高浓度芘胁迫(135、405 mg/kg)下与对照组相比,京翠70的 MDA含量显著降低(41.51%),京春绿和北京桔红二号略有下降但不显著。

表1 芘胁迫对白菜生物量的影响

表中数据为3次重复的平均值±标准误；不同小写字母代表在0.05水平上差异显著

图1 芘胁迫对白菜丙二醛(MDA)的影响Fig.1 Effect of pyrene stress on Malondialdehyde content of Chinese cabbage图中同一品种白菜小写字母相同表示浓度间无显著性差异;京翠60(JC-60);京秋65(JQ-65);京春娃2号(JCW-2);京春白(JCB);京翠70(JC-70);京春绿(JCL);桔红2号(JH-2);中白50(ZB-50);吉红308(JH-308);菊心(JX);快菜1号(KC-1)

2.3 叶绿素

对叶绿素a和叶绿素b进行双因素方差分析,结果显示白菜的品种和芘的浓度都会显著影响白菜叶绿素a和叶绿素b的含量(P<0.001)。叶绿素是高等植物进行光合作用的重要色素,直接影响到植物的光合作用,叶绿素含量的变化可以作为衡量叶片衰老的重要生理指标[20],也能在一定程度上反映植物的代谢情况和抗逆性[21]。如图2和图3所示,同种白菜的叶绿素a和叶绿素b含量随着土壤芘浓度的增加呈现出相同的变化趋势。而11种白菜的叶绿素含量在芘胁迫下存在不同的变化规律：一是叶绿素含量在低浓度芘胁迫下(5 mg/kg)有上升趋势,如京翠60、京秋65和菊心三种白菜,其中京翠60的叶绿素a和叶绿素b含量显著升高,分别升高106.9%和102.8%；在中低浓度芘处理(15、45 mg/kg)下,叶绿素含量略有下降趋势,相比对照组,叶绿素a和叶绿素b分别降低了9.86%—12.34%和8.25%—20.21%；在高浓度(135、405 mg/kg)胁迫下与对照组相比,京翠60的叶绿素a含量显著升高136.32%,京秋65的叶绿素b含量显著增加157.53%。二是中低浓度芘胁迫下下降,高浓度上升的变化规律,如京春娃、北京桔红、中白50和快菜一号四种白菜在5 mg/kg芘浓度下叶绿素a含量降低了7.83%—23.71%,叶绿素b含量降低了16.9%—39.74%；在中高浓度(45、135、405 mg/kg)的芘胁迫下呈现上升的趋势,叶绿素a和b的增加率分别为1.53%—21.34%和2.51%—18.86%。三是叶绿素含量随着胁迫浓度的增加而逐渐升高,如京春白、京翠70、京春绿和吉红308四种白菜,在405 mg/kg浓度芘胁迫下,4种白菜的叶绿素a和叶绿素b分别升高了84.1%—122.53%和77.37%—120.29%。

图2 芘胁迫对白菜叶绿素a的影响Fig.2 Effect of pyrene stress on chlorophyll a content of Chinese cabbage图中同一品种白菜小写字母相同表示浓度间无显著性差异

图3 芘胁迫对白菜叶绿素b的影响Fig.3 Effect of pyrene stress on chlorophyll b content of Chinese cabbage图中同一品种白菜小写字母相同表示浓度间无显著性差异

3 讨论

3.1 芘胁迫对生物量的影响

植物的生物量变化是植物在受到胁迫时最直观的表现指标,通常植物对多环芳烃的胁迫有一定的耐受阈值,阈值内植物生物量变化不明显,阈值以外则生长受到抑制[22]。在本研究中,生物量在芘胁迫下表现两种变化规律,京翠60和京秋65这两种白菜品种随着芘浓度的增加,生物量有逐渐下降趋势,可能是PAHs阻碍植物根系从被污染土壤中吸收养分和水,进而影响植物的生长和生理特性[23]。而另外9种白菜生物量呈现“倒U型”变化趋势,在芘胁迫下生物量表现为低浓度升高,高浓度降低,这与尹东雪等[24]采用芘对拟南芥毒性效应的研究以及陆志强[25]、洪有为等[26]对秋茄在芘胁迫下的生长情况研究结果是一致的。高浓度的多环芳烃对植物的生长具有抑制的作用,使植物的根毛减少、叶片发黄、株高下降、生物量显著降低[13]。而在低浓度的多环芳烃胁迫时,对植物起到了刺激作用,目前大多认为低浓度的刺激作用可能是因为PAHs的环状结构与植物体内的生长素等内源激素具有相似性,使其具有与生长素相似的作用[27],促进植物生长。

3.2 芘胁迫对MDA的影响

多环芳烃会对植物产生氧化胁迫,破坏细胞膜结构,造成细胞内电解质外渗率增大,丙二醛(MDA)含量可以一定程度上反应细胞受伤害和对逆境的反应程度[28]。白菜在不同芘的浓度条件下,丙二醛含量存在不同的变化规律。在本研究中部分白菜品种在中低浓度的芘处理下MDA含量无显著变化,在高浓度芘胁迫下,白菜MDA含量均显著升高,这与蔡顺香等[29]人和朱灿等[30]人的研究结果一致,说明这些白菜品种在中低浓度芘胁迫下细胞受到的损害较小,而高浓度的芘会对植物造成一定程度的损伤。同时研究发现部分白菜品种在受到芘胁迫时,MDA含量均显著降低,在胁迫浓度范围内均未高于对照组,推测多环芳烃在一定的浓度下会对植物的正常应激性机制造成伤害[21,23],长时间暴露在多环芳烃胁迫下抗氧化酶的酶活力会被诱导[32- 33],导致脂质过氧化作用产生的MDA含量降低。也存在植物在多环芳烃胁迫下代谢失衡产生活性氧,作为信号分子传导到植物体内后触发抗氧化系统的防御机制,进而适应环境[34- 35]。

3.3 芘胁迫对叶绿素含量的影响

一般认为土壤有机物污染会破坏植物体内的叶绿素合成酶,或者激活叶绿素降解酶,导致叶绿素含量下降[20],但也存在抗逆性较强的植物,在有机物胁迫下叶绿素含量上升[36]。我们研究发现多环芳烃芘的添加量会对白菜叶绿素含量产生一定的影响,如京翠60、京秋65等这些白菜品种中的叶绿素含量在低浓度芘处理下有上升的趋势,在中浓度的胁迫下略有下降的趋势,变化不显著,在高浓度胁迫下与对照组相比叶绿素含量显著升高。唐璇[37]研究发现,中浓度的多环芳烃胁迫萝卜幼苗,叶绿素b的合成受到抑制,高浓度胁迫下促进叶绿素a的合成,同时尹东雪等[24]用芘对拟南芥生物毒性的研究中,叶片的叶绿素呈现出先上升后下降的趋势,与本实验在中低浓度下的反应相似,可能是在低浓度的污染下,相关的酶活性未受到抑制,植物可以充分自我调节。同时,京春白等4种白菜随着芘浓度的增加,叶绿素含量呈现逐渐增高的趋势,在高浓度芘胁迫下与对照组相比显著升高。与蔡顺香等[38]用芘对小白菜(日本华京冠菜)幼苗胁迫的实验结果相反,而孙成芬等[39]在土壤萘对玉米苗期的生理影响的研究中发现在培养3周后,叶片中的叶绿素含量大于对照组,陆志强[40]也通过芘和萘对秋茄幼苗的胁迫中发现了对叶绿素的促进效应,在与本实验结果相似。京春娃等白菜品种中的叶绿素含量呈现中低浓度芘胁迫下降,高浓度上升的变化趋势,变化不显著。杨志峰等[41]通过芘对辣椒的胁迫实验中,发现芘浓度为50 mg/kg时叶绿素含量达到最小值,而中高浓度胁迫下叶绿素略有增加,与本实验结果一致。赖闻玲等[42]研究菖蒲在萘胁迫下的生理影响时发现随时间推移菖蒲逐渐适应萘污染,叶绿素恢复正常水平,推测本实验中白菜在高浓度芘胁迫下生长能够逐渐适应,叶绿素开始升高。有研究[43]表明,脯氨酸是植物体内的渗透调节物质,会随着芘浓度的增加而急剧增长,能够缓解芘胁迫下对细胞的伤害使叶绿素含量升高。

4 结论

(1)华北地区11种白菜在中低浓度(5、15、45 mg/kg)的芘胁迫下,生物量未显著下降甚至出现升高的现象,说明白菜在中低浓度芘污染的土壤中对其生长抑制作用较小,而在高浓度(135、405 mg/kg)胁迫时不能够正常的生长。

(2)除京翠60、京翠70和京春绿外,其余8种白菜MDA含量在中低浓度的胁迫下变化无显著性差异,也说明白菜在中低浓度下受到细胞损害较小,其中京春娃二号、京春白和中白50即使在高浓度芘胁迫下与对照组相比,MDA含量也未有显著增加,推测其对芘的耐受性较好。

(3)11种白菜中叶绿素a含量均大于叶绿素b含量,且在不同芘浓度的胁迫下两种叶绿素具有相似的变化规律和显著性,即芘对白菜叶绿素a和b的胁迫作用相似。在中低浓度芘胁迫下,京翠60、京翠70和京春绿叶绿素含量显著升高,京春娃二号叶绿素含量显著降低。其余7种白菜品种均变化不显著,且在高浓度胁迫中有升高的趋势,与植物自身抗性的阈值有关[41],具体机制还有待进一步研究。

大部分白菜在中低浓度的土壤芘胁迫下受到影响较小,高浓度胁迫下受到损伤无法正常生长。其中,京春白和中白50对芘的胁迫具有良好的耐受性,生理指标变化较小；京翠60和京春绿对于中低浓度芘胁迫下较为敏感,生理指标变化较大,可以作为中低浓度芘污染土壤的指示作物；高浓度芘处理下,京秋65、吉红308的生理指标变化显著,可以作为高浓度芘污染土壤的指示作物。