采收期、贮藏时间及加工单元操作对赣南脐橙汁苦味物质含量的影响

卢剑青，周明，蔡志鹏，王静，朱丽琴，李晓明，罗运梅，陈金印，沈勇根*

1(江西农业大学 食品科学与工程学院，江西省发展与改革委员会农产品加工与安全控制工程实验室，江西 南昌，330045) 2(江中食疗科技有限公司，江西 九江，332020)3(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510630) 4(江西农业大学 农学院，江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，江西 南昌，330045)

脐橙，芸香科柑橘属橙类[1]，富含VC、糖、有机酸、类黄酮、类柠檬苦素等营养物质，对调节人体代谢、维持机体健康大有裨益，深受广大消费者的喜爱[2-3]。赣南脐橙是我国脐橙的知名品牌，获得国内外专家学者的一致称誉，但其约90%都用于鲜食，深加工产品不足[4]。果汁作为脐橙的主要加工产品之一，能够极大程度地利用脐橙资源，然而脐橙在制汁后产生的“后苦味”，是一直制约着脐橙进行加工的主要因素，同时也影响着我国柑橘产业的进一步发展。

前人研究表明，柠檬苦素和诺米林是造成橙汁加工过程中出现“后苦味”的主要物质，而柠檬苦素在果实中主要以柠檬苦素-A-环内酯(limonin A-ring lactone，LARL)的形式存在，榨汁时从果实中溶出，逐渐转变成柠檬苦素等苦味物质，且该转变过程在酸性或热处理条件下表现的更明显[5-7]。虽然柠檬苦素有促进人体代谢、抗氧化、消炎镇痛、抗癌潜力等诸多益处[8-11]，但因其在果汁中苦味阈值较低，严重影响了果汁的口感。柠檬苦素在果汁中的苦味阈值约为3.4 mg/L，其苦味程度比柚皮苷的苦味高约20倍[12-13]。毕静莹[14]研究显示，在纯净水中诺米林的识别阈值是柠檬苦素的1.29倍，但是在模拟柑橘汁中柠檬苦素和诺米林的苦味识别阈值分别约为4.67 mg/L和4.61 mg/L。针对橙汁加工的“后苦味”脱除问题，学者们进行了大量研究，提出了吸附脱苦、膜分离脱苦、酶法脱苦、固定细胞法等多种脱苦工艺，各种方法的脱苦效率不一，然而将其扩大至工业化使用仍然有一定的缺陷[13, 15-17]。国内外大量研究指出，脐橙果实在成熟过程中，柠檬苦素前体是逐渐降低的[18]，但对于赣南脐橙普遍的采收期内以及果实在贮藏过程中，其制备橙汁中的苦味物质含量变化未见相关报道。同时因普遍研究认为柠檬苦素是橙汁中主要的“后苦味”物质，针对诺米林在加工过程中含量变化的研究较少。虽然橙汁中诺米林含量比柠檬苦素低很多，但DEA等[19]指出，柠檬苦素和诺米林的协同作用会使2种苦味物质的阈值均降低，仅为柠檬苦素浓度一半的诺米林会增加橙汁的苦感。

本研究采用高效液相色谱分析法，系统地研究了脐橙果实采收、贮藏及加工单元操作对橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的影响，并深入研究热处理温度和pH值对橙汁中苦味物质含量的影响,以期得出脐橙加工较适宜的采收与贮藏期，并为寻求新的脱苦途径提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

脐橙于2018年11月13日采自江西省宁都县，品系为纽荷尔脐橙，采样时选择长势、高度均一的果树，选取果径接近的果实作为试验样品。

1.1.2 主要试剂

乙腈(色谱纯)，美国天地有限公司；二氯甲烷(分析纯)，西陇科学股份有限公司；柠檬苦素(纯度≥98%)，北京索莱宝科技有限公司；诺米林标准品(纯度≥98%)，上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸(食品级)， 河南万邦实业有限公司；NaHCO3(食品级)，潍坊绿鑫经贸有限公司。

1.2 仪器与设备

Aglient 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；JNO26675型低速离心机，上海安寿科学仪器厂；BSA124S型电子分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；SB3200DTDN型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；QL-901涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；MJ-PB40E253C加热破壁营养料理机， 广东美的生活电器制造有限公司；SPY-60实验型高压均质机，上海顺仪实验设备有限公司；JM140胶体磨-立式，温州市胶体磨厂。

1.3 试验方法

1.3.1 脐橙采收与贮藏期样品处理

脐橙果实采收和贮藏试验均以10 d为1个周期，果实贮藏温度为4 ℃。在每个试验周期，分别测定取汁后不作任何处理的橙汁和取汁后在70 ℃热处理30 min后的橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量。

1.3.2 模拟橙汁加工关键单元操作

挑选完整、良好，大小和色泽均一的赣南脐橙果实去皮，榨汁后混合均匀，加工单元对果汁影响试验分别采用挤压和破碎的方式取汁，分为2条加工工艺，即挤压(或破碎)→过滤(200目)→酶解澄清(800 mg/L果胶酶45 ℃保持4 h后过滤)→胶体磨(胶体磨处理5 min)→均质(均质2次，前后2次均质压力分别为35和40 MPa)→浓缩(可溶性固形物减压浓缩至55%后复原至原果汁含量，下文统称浓缩)。

1.3.3 不同温度和pH对橙汁热处理

热处理条件对果汁品质影响试验统一采用压榨的方式取汁:(1)将混匀后果汁分别等量取10 mL分装于离心管中，分别在50，60，70，80，90，100 ℃下热处理5～30 min(每个温度间隔5 min取1次样);(2)将原果汁分别用柠檬酸和NaHCO3调果汁pH值为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0。在70 ℃条件下热处理5～30 min(每个温度间隔5 min取1次样)。

1.3.4 苦味物质含量测定

参考陈静等[20]和李一兵等[21]的方法利用超声波辅助提取橙汁中的柠檬苦素和诺米林，改进后方法如下：使用二氯甲烷作为萃取剂，将待提取橙汁和二氯甲烷以体积比1∶1(该试验橙汁和二氯甲烷均取10 mL)加入50 ml带盖离心管中，涡旋振荡后，室温下160 W功率超声提取40 min，后于3 000 r/min的转速离心10 min，分离出下层清液，剩余成分再加入二氯甲烷提取1次，步骤同第1次。将2次得到的下层清液合并，使用旋转蒸发仪以60 ℃蒸干后，加入1.5 mL乙腈溶解，并过0.22 μm有机滤膜，置于HPLC进样瓶中待测。

使用HPLC同时检测柠檬苦素和诺米林进行检测，该试验设定参数如下：检测波长210 nm；进样量10 μL；柱温 30 ℃；流动相为乙腈和超纯水，V(乙腈)∶V(超纯水)=11∶9，以流速1 mL/min等度洗脱20 min。

1.3.5 动力学模型拟合分析

通过观察苦味物质随温度、时间变化的趋势，并参照阮卫红等[22]的方法，采用零级、一级动力学和联合反应动力学模型进行拟合,分别如公式(1)、公式(2)、公式(3)所示：

C=C0+k0t

(1)

C=C0e(k1t)

(2)

C=k0/k1-(k0/k1-C0)e(-k1t)

(3)

式中：C为任意时间指标的测定值；C0为该指标的起始值；t表示时间，min；k0、k1分别表示零级动力学和一级动力学的反应常数。

1.3.6 统计与分析

实验过程中分别对每个处理组进行3次重复，试验数据采用Excel 2016和Origin 9.1以及SPSS 22.0进行统计分析。各项指标以平均数±标准差表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同采收期脐橙制备的橙汁中柠苦素及诺米林含量的变化

因预实验显示热处理会大幅提高橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量，故对每个采收期的脐橙制备的橙汁，分别测定其未热处理与热处理后的柠檬苦素和诺米林含量。如图1所示，在整个试验期内热处理橙汁中的柠檬苦素和诺米林含量均表现出显著降低的趋势(P<0.05)，12月23日相比于11月13日，热处理橙汁中柠檬苦素和诺米林含量分别降低了47.57%、75.15%。橙汁中诺米林含量相比柠檬苦素更低，且未热处理橙汁在12月23日时的诺米林未被检出，不同的是，未热处理橙汁中的柠檬苦素在11月23日后均无显著差异(P>0.05)。

WU等[23]研究柑橘成熟过程中以及朱春华等[24]研究柠檬果实生长过程中柠檬苦素的变化趋势，与本试验相吻合。脱乙酰诺米林酸和诺米林是柑橘中柠檬苦素的前体物质，其在茎的韧皮部进行合成，在生长过程中向植物的叶、果实、种子等组织中转移，并且在种子和果实中通过代谢等方式逐渐转化为LARL等类柠檬苦素化合物。随着果实成熟度的增加，绝大部分类柠檬苦素苷元会逐渐转化为无苦味的类柠檬苦素糖苷(limonoids glucoside,LG)，即LARL的葡萄糖共氧化形成柠檬苦素17-β-D-吡喃葡萄糖苷等，但是柠檬苦素类化合物总量(LARL+LG)积累至一定水平后趋于稳定，这是一个自然的去苦味过程[16,25-26]。在该试验中，延长脐橙的采收时间，使更多的类柠檬苦素苷元继续转化成糖苷，从加工的源头降低橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量。

JUNGSAKULRUJIREK等[27]研究指出，延长采收时间对于柑橘汁胞中产生柠檬苦素的含量无显著影响，但种子、果皮和囊衣中产生的柠檬苦素含量显著降低。在脐橙取汁过程中，果皮和囊衣中产生的柠檬苦素会溶出至橙汁中，因此加工过程中的取汁方法对橙汁中苦味物质含量起决定性作用。

A-柠檬苦素；B-诺米林图1 不同采收期脐橙制备橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的变化Fig.1 The change of limonin and nomilin during different harvest periods注：不同小写字母表示不同采收期脐橙制备橙汁加热处理和未处理的10个样品之间的柠檬苦素和诺米林含量差异显著(P<0.05)

2.2 不同贮藏期脐橙制备的橙汁中柠檬苦素及诺米林含量的变化

如图2所示，脐橙贮藏过程中，未加热和加热处理的橙汁中柠檬苦素含量变化趋势类似，均表现出先升高后降低的趋势。在贮藏第20天时，柠檬苦素含量达到最高，未加热橙汁柠檬苦素含量为5.77 mg/L，加热橙汁为13.23 mg/L，相比贮藏0 d时分别提高了101.23%、128.42%。贮藏20 d之后呈明显下降趋势，至第70天时，未加热橙汁和加热橙汁相比第0天时，分别降低了65.66%、48.33%。未加热和加热处理的橙汁中诺米林含量也表现出先上升后降低的趋势，在脐橙贮藏第20天达到最高，未加热橙汁的诺米林含量为0.88 mg/L，加热橙汁为1.13 mg/L，相比贮藏0 d时分别提高了86.73%、117.45%。值得注意的，当脐橙贮藏40 d及后续贮藏过程中，在未加热和加热处理的橙汁中均未检出诺米林。

与刘萍等[28]在对不同贮藏条件对沙田柚苦味物质含量变化的趋势类似，不论是常温还是4 ℃贮藏条件下，在果实汁胞中的苦味物质的含量均呈现先上升后下降的趋势，且常温条件下柠檬苦素含量上升时间较4 ℃贮藏的提前。可能是在一定的贮藏期内，果实的抗逆性增强或者是部分柠檬苦素的配糖体在酶的作用下降解成苷元，从而导致柠檬苦素表现出先升高的趋势[29]。随着后续冷藏的进行，在游离单糖作为底物的条件下，柠檬苦素苷元又被柠檬苦素葡萄糖基转移酶转化成糖苷，导致后降低的趋势[30]。

而刘珞忆等[31]研究的奉节脐橙果实的柠檬苦素含量在低温贮藏0～30 d呈先上升后下降，贮藏30 d后逐渐上升趋势。丁帆等[32]在研究贮藏温度对温州蜜柑柠檬苦素含量变化中，显示在贮藏后期柠檬苦素含量在贮藏0～40 d内呈先上升后下降，贮藏40 d后逐渐上升趋势，与本试验研究结果不一致。但类似的是，其在贮藏0～20 d时，柠檬苦素含量显著上升，与本试验贮藏前期相吻合。由此推测，在本试验脐橙贮藏10～30 d之间，是苦味物质受低温影响的敏感时期，与袁奇等[33]的结论相符。

A-柠檬苦素；B-诺米林图2 不同贮藏期脐橙制备的橙汁中柠檬苦素及诺米林含量的变化Fig.2 The change of limonin and nomilin during different storage periods注：不同小写字母表示不同贮藏期脐橙制备的橙汁的16个样品之间柠檬苦素和诺米林含量差异显著(P<0.05)

2.3 加工单元操作对橙汁中苦味物质含量的影响

由图3、表1可知，采用破碎工艺制备的橙汁中的柠檬苦素和诺米林均显著高于采用挤压工艺制备的橙汁，过滤使橙汁中柠檬苦素含量略微上升，但无显著性差异。酶解后橙汁中的柠檬苦素含量显著升高(P<0.05)，采用挤压工艺和破碎工艺制备的橙汁中的柠檬苦素含量相对酶解前分别增加了3.28、4.02 mg/L。而2种取汁工艺的橙汁中的诺米林在酶解处理后以及后续单元操作，均未被检出。胶体磨处理，使破碎汁略微下降(P>0.05)，却使挤压汁显著上升，至接近破碎汁柠檬苦素含量。均质和浓缩复原处理对前一操作单元橙汁均无显著影响。

结果表明，在本试验加工操作单元中，取汁方法和酶解是影响橙汁苦味物质含量的主要单元。在取汁过程中，破碎取汁工艺将囊衣打碎，使其与橙汁充分混合，同时较挤压取汁工艺获得的橙汁更浓稠。柠檬苦素难溶于水，但果汁中的果胶会增加柠檬苦素和诺米林的溶解度[34]，从而导致破碎取汁工艺制备橙汁的苦味物质含量比挤压取汁工艺制备的橙汁更高。

酶解过后，橙汁未检出诺米林，可能因为在长时间热处理后诺米林自身降解以及转化为诺米林酸等其他类柠檬苦素。而柠檬苦素在酶解后显著上升，在胶体磨、均质处理后略微降低，在加工过程中柠檬苦素含量的降低原因可能是单元操作会导致类柠檬苦素结构改变以及活性的损失，影响柠檬苦素稳定性的主要原因有pH值、热处理温度、与空气接触时间等[35]， 同时BARTON等[36]研究发现，在70 ℃下热处理5 h，柠檬苦素会被水解成为类柠檬苦素苷元和葡萄糖。而在酶解过程中柠檬苦素含量的上升，是柠檬苦素生成量大于损失量导致。但在该过程中柠檬苦素前体、柠檬苦素和柠檬苦素糖苷之间的具体转化情况尚不清楚，需进一步研究柠檬苦素、诺米林在该过程中的转化及产物的变化情况。

图3 橙汁加工过程中柠檬苦素含量的变化Fig.3 The change of limonin content in orange juice processing注：不同小写字母表示不同加工操作单元挤压汁、破碎汁的12个样品柠檬苦素含量差异显著(P<0.05)

表1 橙汁加工过程中诺米林含量的变化 单位：mg/L

2.4 pH值及温度对热处理橙汁中苦味物质含量的影响

由图4可知，在相同的处理温度时，随着加热时间的增加，橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量均增加。在相同的加热时间时，随着处理温度的增加，橙汁中的柠檬苦素和诺米林的含量也随着增加。冯桂仁等[37]对胡柚汁进行热处理的柠檬苦素的变化规律也显示类似的趋势。而热处理对果汁中诺米林含量的变化却鲜有研究。50 ℃热处理时，随着加热时间的延长，橙汁中的柠檬苦素含量增加速率较慢，30 min后，柠檬苦素含量为1.41 mg/L。同时60、70、80、90、100 ℃热处理下橙汁的柠檬苦素含量明显高于50 ℃热处理下的橙汁。热处理过程中诺米林含量变化规律与柠檬苦素类似，但90、100 ℃热处理下橙汁的诺米林含量明显高于50、60、70、80 ℃热处理下的橙汁。

由表2、表3可知，固定橙汁的pH值时，随着加热时间的延长，橙汁中的柠檬苦素和诺米林含量均呈增加的趋势。另外，本次研究表明酸性条件下会极大促进热处理过程中橙汁柠檬苦素和诺米林的生成，pH=3.0时，在初始5 min，柠檬苦素与诺米林的含量分别达到了3.96、10.14 mg/L，当pH≥6.0时，橙汁在30 min的热处理时间内柠檬苦素含量低至无法检出；而pH≥5.0时，诺米林已经无法检出。此次研究结果表明热处理过程中，处理温度、时间、pH值是影响橙汁柠檬苦素和诺米林含量的主要因素。

酸性条件和加热条件是使橙汁 “后苦味”增加更快的主要原因[13, 37]。本次试验结果表明，在酸性环境下，橙汁中的柠檬苦素和诺米林产生速率更快，而当pH值逐渐上升至中性时，橙汁中柠檬苦素和诺米林相继无法被检出。这可能是因为pH值逐渐升高的过程中，柠檬苦素前体物质转化为柠檬苦素的效率逐渐降低。MAIER等[38]指出LARL和柠檬苦素之间的转化是D环的开环和闭环，且该反应是可逆的，当pH<6.0时，柠檬苦素-D-环内酯水解酶促进无苦味的LARL反应生成有苦味的柠檬苦素。当pH>8.0时，柠檬苦素即会被水解成LARL。因此柠檬苦素-D-环内酯水解酶的活性决定了橙汁中的柠檬苦素的含量，当控制橙汁体系中的pH值时，在一定程度上可以调控橙汁中的柠檬苦素含量。本次试验时，当调节橙汁的6.0≤pH≤8.0时，在初始过程柠檬苦素-D-环内酯水解酶可能是未参与D环闭合反应或活性较低，从而导致在热处理30 min内，均未检测到柠檬苦素的生成。但目前柠檬苦素-D-环内酯水解酶的结构与酶反应动力学均未缺乏系统的研究，且酶活性的检测也缺乏相应的方法，后续将开展热处理过程中pH值、温度及时间等参数对柠檬苦素D环内酯水解酶活性的影响。

综合热处理结果推测，促进LARL转化成柠檬苦素的酶可能具有较好的耐热性，又或者该转化过程并非酶促反应，而酸性环境是柠檬苦素D环闭合的最主要原因。

A-柠檬苦素；B-诺米林图4 不同温度热处理过程橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的变化Fig.4 The change of limonin and nomilin content of orange juice during heat treatment at different temperatures

表2 不同pH热处理过程橙汁中柠檬苦素含量的变化 单位：mg/L

表3 不同pH值热处理过程橙汁中诺米林含量的变化 单位：mg/L

2.5 橙汁热处理过程中苦味物质含量变化规律的动力学研究

橙汁在热处理过程中苦味物质含量变化与很多因素有关，目前变化机理还没有被阐述清楚，而动力学模型是变化规律和基础反应理论相结合的，能够阐述食品组分在贮藏加工过程中的变化过程，同时也能通过动力学模型拟合对食品贮藏加工过程中组分含量变化定量描述[39]。前人已经对食品贮藏加工过程中不同处理对水分[40]、VC[41]、多酚[42]等组分变化的动力学模型展开了系统深入的研究，但对橙汁中苦味物质的变化缺乏研究。由表4、表5可知，在50、60、70、80、90及100 ℃的热处理过程中，橙汁柠檬苦素含量的变化与联合反应模型的拟合度更高，回归系数R2最大，分别为0.999、0.974、0.988、0.962、0.967、0.977。类似的是，在50、60、70、80、90及100 ℃的热处理过程中，橙汁诺米林含量的变化也和联合反应模型的拟合度更高。结果表明,可用联合反应模型拟合不同温度热处理下橙汁中柠檬苦素和诺米林含量随着加热时间的变化。

表4 不同温度热处理时橙汁中柠檬苦素变化规律的动力学参数Table 4 Values of the heat treatment constant and coefficient of the model for limonin in orange juice under different temperatures

由表6、表7可知，在调节pH值为3.0、4.0、5.0的橙汁在热处理过程中，橙汁柠檬苦素含量的变化与联合反应模型的拟合度更高，回归系数R2最大，分别为0.998、0.916、0.996。且在调节pH值为3.0、4.0的橙汁在热处理过程中，橙汁诺米林含量的变化也和联合反应模型的拟合度更高，其R2分别为0.961、0.921。结果表明可用联合反应模型拟合不同pH值橙汁在热处理过程中柠檬苦素和诺米林含量随着加热时间的变化。

表5 不同温度热处理时橙汁中诺米林变化规律的动力学参数Table 5 Values of the heat treatment constant and coefficient of the model for nomilin in orange juice under different temperatures

表6 不同pH值热处理时橙汁中柠檬苦素变化规律的动力学参数Table 6 Values of the heat treatment constant and coefficient of the model for limonin in orange juice under different pH

3 结论

脐橙的采收贮藏期、橙汁的加工单元操作均对橙汁中柠檬苦素与诺米林的含量影响较大，考虑到橙汁的口感，在保证其他营养品质在可接受范围内，可以延后采收时间和采用贮藏30 d后的脐橙进行橙汁的制备。

在加工过程中，应从取汁方法、热处理参数等来控制橙汁的苦味物质含量，可以采用挤压取汁和低温灭菌，如超高压灭菌等。

表7 不同pH值热处理时橙汁中诺米林变化规律的动力学参数Table 7 Values of the heat treatment constant and coefficient of the model for nomilin in orange juice under different pH

橙汁pH值和热处理的温度对橙汁中苦味物质影响较大，且在100 ℃下仍能促进橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的增加。随着pH值的升高，橙汁中苦味物质逐渐降低，当pH值>6.0时柠檬苦素和诺米林均未检出。综合来看，柠檬苦素-D-环内酯水解酶具有较好的耐热性，又或者LARL转化成柠檬苦素的反应只是和酸碱性有关，并非酶促反应。

综上所述，在实际橙汁生产加工过程中，可参考以上结论并根据实际生产需求确定合适的脐橙加工原料和生产工艺，以降低橙汁的苦感至消费者可接受范围内。