浓香型白酒窖泥放线菌的原位分离及代谢特性研究

罗碧霞，郑若欣，程铁辕，任志强，卫春会，邓杰，黄治国*

1(酿酒生物技术及应用四川省重点实验室(四川轻化工大学)，四川 宜宾，644000)2(四川国检检测有限责任公司， 四川 泸州，646000)3(宜宾海关，四川 宜宾，644000)

浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，不同窖龄的窖池有着不同的微生物群落结构[1-2]。窖泥中栖息着种类多样、数量丰富的微生物，这些微生物随着窖池的使用不断得到驯化，进而构成了独特的微生态区系，这些微生物的群落结构和演替影响着白酒的质量[3-4]。酒醅为窖泥中的微生物提供其生长所需的碳源、氮源、生长因子等各类营养物质，窖泥中的微生物则生长代谢产生己酸、乳酸、丁酸、乙酸等酸类，进一步在窖泥或酒醅中酯化酶的作用下生成各种酯类[5-6]。浓香型白酒主体香味成分己酸乙酯的生成与窖泥微生物有最直接的关系，研究窖泥微生物意义重大。据相关资料[7]表明，窖泥微生物的研究主要包含酵母菌、霉菌、细菌、放线菌，相对而言，放线菌的相关研究较少，其中有关浓香型白酒酿造环境中放线菌的研究还远远不够[8]。王涛等[9]对浓香型白酒酿造相关放线菌发酵液中的主要醇溶性和水溶性挥发性产物进行GC-MS分析发现代谢产物有醇类、酯类、醛类、酸类。周敬波等[10]对放线菌的产酶能力进行研究，发现实验菌株具有很强产淀粉酶、产蛋白酶能力。郭威等[11]发现放线菌的产酶能力与其促己酸菌产己酸能力是有一定关联的。这些研究都表明了放线菌在白酒生产中具有较高的可研究前景和可开发价值。

对于窖泥放线菌研究来说，多采用直接从窖池取回窖泥进行筛菌工作，可以直观地获得该时期该窖泥中的微生物，但是会大概率无法分离得到放线菌，可能是由于所取样品无放线菌或者放线菌在该时期的生存能力较弱导致的难以筛选，针对于这一不足，利用细菌不能产生菌丝，就无法透过滤膜进入原位培养基中，丝状真菌菌丝体较粗，同样会被滤膜阻隔，酵母菌不产生菌丝，菌体也较大，因而也不能透过滤膜，只有放线菌可穿过滤膜这一原理，自制原位培养装置，埋放于窖泥中富集放线菌。原位培养(in situ cultivation)可以模拟自然环境，富集菌体，有利于提高微生物，特别是某些未培养微生物(uncultivated microorganisms)的获取率[12-13]。

本试验通过高通量测序技术对窖泥细菌群落结构进行分析，进一步对放线菌多样性进行分析，筛选分离出放线菌，以系统发育特征及生理生化特征对菌株进行鉴定，并对其相关耐受性和代谢特性进行研究，为探究放线菌在窖泥中的功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品

窖泥取自川南某浓香型白酒生产企业一口50年窖龄且发酵正常的窖池。

1.2 主要试剂

KNO3、NaCl、KH2PO4、葡萄糖、重铬酸钾(均为分析纯)，成都市科龙化工试剂厂；酵母膏、麦芽浸粉、蛋白胨(均为生物试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司；结冷胶(食品级)，郑州市中成化工。

1.3 仪器与设备

DM500生物显微镜，德国Leica公司；C1000 Touch PCR仪、ChemiDocXPS+凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司；5430离心机，Eppendorf公司；固相微萃取头(50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS)，美国Supelco 公司；5975B-7890A气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技中国有限公司。

1.4 培养基

原位培养基：黄水1 L，琼脂粉1.5%(质量分数)，结冷胶0.5%(质量分数)，自然pH值。

纯化培养基：高氏Ⅰ号培养基[14]。

YEME培养基：葡萄糖10 g，蔗糖100 g，蛋白胨5 g，麦芽浸粉3 g，酵母膏3 g，蒸馏1 L，灭菌后加MgCl2(2.5 mol/L) 2 mL，灭菌条件为121 ℃，15 min。

以上培养基所用无机盐均为水合盐，下同，均添加1%琼脂和0.5%的结冷胶做凝固剂[15-16]，添加75 μg/mL的重铬酸钾[17]，5 mL/L的黄水，调节pH 7.0～7.4，均在121 ℃下灭菌15 min。

燕麦汁培养基：生燕麦片20 g，可溶性淀粉10 g，微量盐溶液1 mL(FeSO40.1%，MgCl20.1%，ZnSO40.1%)(质量分数)，自然pH值，灭菌条件为121 ℃，15 min。

固态发酵培养基：燕麦粉50 g，微量盐溶液1 mL(KNO31%、KH2PO40.5%、MgSO40.5%，FeSO40.1%，NaOH 0.8%)(质量分数)，pH自然，灭菌条件为121 ℃，15 min。

1.5 窖泥中微生物群落结构分析

取中、下、底3个空间位置的窖泥，3点取样，混合均匀，取回冷冻。送往上海美吉生物医药科技有限公司，采用通用引物968FMID-1401R，参照邓杰等[18]的方法完成高通量测序工作，对测序数据利用Mother软件进行分析，结果采用平均值±标准误差的形式表示。

1.6 放线菌的分离纯化与鉴定

1.6.1 放线菌的分离纯化

参照姜明国等[19]分离红树林根际土壤放线菌所用原位培养装置(图1-a)与闫志英等[20]发明的一种原位分离产纤维素酶放线菌的装置，自制原位培养装置(图1-b)。将其分别埋放在窖底和窖壁下层泥下1 cm左右，约70 d后取回捣碎，称取10 g加入90 mL 0.85%(质量分数)无菌生理盐水，振荡均匀，静置2 h后梯度稀释至10-1、10-2、10-3，涂布至高氏I号培养基，28 ℃恒温培养5 d，每个稀释度3组平行。挑取具有放线菌典型菌落形态特征的单菌落[21]，纯化培养2～3次，最后以试管斜面-4 ℃保藏备用。

a-放线菌原位俘获装置；b-自制原位培养装置图1 原位培养装置Fig.1 The chamber of in situ cultivation

1.6.2 放线菌的初步鉴定

参照《放线菌系统分类技术》[21]用插片法并滴加美蓝染液观察菌体形态，并进行明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、纤维素分解、硝酸盐还原、H2S的产生这6组生理生化试验。

1.6.3 放线菌DNA提取、扩增及测序

利用土壤基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)提取放线菌DNA，采用细菌16S rRNA基因扩增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)，参照张洪伟等[22]的反应体系，进行PCR扩增。将PCR反应产物送上海杰李生物技术有限公司进行纯化和测序。在NCBI官方网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行序列同源性比对，采用 MEGA 7.0构建系统发育树，获得目的菌的分类地位及其近缘系统发育地位。

1.7 放线菌的耐受特性研究

1.7.1 放线菌的耐酸性研究

菌株发酵采用YEME液体培养基。每组发酵罐分装1 200 mL培养基，用浓盐酸和1 mol/L NaOH溶液分别调节pH值至3.0、4.3、5.6和7.0。脱脂棉堵住发酵罐各开口，121 ℃灭菌30 min后使用。控制发酵温度为28 ℃，搅拌转速100 r/min，通气流量(经空气过滤器)25 L/h。每隔12 h取1次样，每次取样25～30 mL。

试验以菌体干重法分析菌株生长情况[23]。准确吸取25 mL发酵液样品5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，带管于80 ℃烘干至恒重(2次称量差<0.002 g)。

1.7.2 放线菌的乙醇耐受性研究

用无菌的无水乙醇调节发酵液酒精度至2%vol、4%vol、6%vol和8%vol，其余操作同1.7.1。

1.8 挥发性产物分析

1.8.1 放线菌液态培养

分别按2%接种量进行接种，于28 ℃条件下培养5 d(液态培养需将转速调至120 r/min)。每组3个平行，密封瓶口，继续培养2 d。

1.8.2 放线菌固态培养

每瓶50 g固态发酵培养基，灭菌后，在无菌条件下分别吸取10 mL菌种液，振荡混匀，28 ℃恒温培养，每隔24 h振荡摇匀1次。菌株A1、A2培养5 d后密封瓶口，继续培养2 d。同时做不添加放线菌菌液的空白试验组，按相同的条件培养并分析。

1.8.3 发酵液挥发性产物分析

采用顶空固相微萃取法提取发酵液挥发性产物。吸取5 mL发酵液加入顶空瓶中，加入1.5 g NaCl，在60 ℃下平衡10 min后，萃取30 min，进样口250 ℃解析2 min，进行GC-MS分析[24]。

气相色谱条件[25]：毛细管色谱柱为J&W 122-7062(60.0 m×250 μm，0.25 μm)；手动分流进样，分流比为12∶1；进样口温度250 ℃；起始温度60 ℃，维持2 min，然后以5 ℃/min升温至200 ℃，维持 1 min，再以20 ℃/min升温至250 ℃，维持2 min；以He为载气，流速为1 mL/min。

质谱条件[25]：电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，恒压10 Pa，质量扫描范围20～550 amu。

1.8.4 燕麦固态发酵醅挥发性产物分析

采用顶空固相微萃取法提取燕麦固态发酵醅的挥发性成分。称取燕麦醅5.0 g/瓶，并加入5 μL 2 004.5 mg/100mL的乙酸丁酯标品进行半定量分析。于60 ℃恒温条件下平衡10 min，后续萃取、分析方法及步骤均同1.8.3。

2 结果与分析

2.1 窖泥细菌多样性分析

对测序数据利用Mother软件按97%归类，划分OTU，得到稀释曲线，见图2，可看出，样品稀释曲线随测序数目的增大而趋于平稳，说明取样合理，数据有效。将细菌OUT分类按门和目进行统计，结果如图3所示。发现该窖泥样品含有丰富的放线菌，含(87±30)个OTUs，占(10.7±3.4)%，仅次于厚壁菌门(Firmicutes)的(42.5±3.0)%和未分类(Unclassified)的(28.6±0.6)%。进一步分析数据，发现放线菌主要分布于未分类(24±7)个OTUs、链霉菌亚目(Streptomycineae)(21±7)个OTUs、科里氏杆菌亚目(Coriobacterineae)(19±6)个OTUs、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)8±3个OTUs、小单孢菌亚目(Micromonosporineae)(7±3)个OTUs、丙酸杆菌亚目(Propionibactrineae)(6±2)个OTUs、另有微球菌亚目(Micrococcineae)(4±2)个OTUs。由窖泥样品中放线菌群落结构的分析结果可以看出，该窖泥中放线菌物种丰富，链霉菌亚目(Streptomycineae)是其中的绝对优势菌群，与王涛等[26]的研究结果一致。对比刘茂轲等[27]、谭崇尧等[28]、刘延波等[29]的研究结果，发现本试验所得到的放线菌种属类更为丰富。首次从浓香型白酒窖泥中分析出Coriobacterineae、Micrococcineae、Bifidobacteriales、Propionibactrineae、Micromonosporineae。

图2 窖泥样品稀释曲线Fig.2 Rarefaction curve in pit mud

图3 放线菌多样性分布图Fig.3 Distribution map of actinomycetes diversity

2.2 放线菌的分离与鉴定

2.2.1 形态鉴定

由原位培养基从窖泥中筛选得到的菌株，经纯化培养后，对具有典型放线菌菌落特征的菌株观察菌落大小、对比生长速度、嗅闻香味，最终筛选出2株具有特殊香气的菌株，分别编号为A1、A2，对菌落形态观察见图4，镜检观察结果见图5。

由图4可知，A1菌落表面干燥，不透明，表面有丝绒感；菌落与培养基结合紧密，培养时间较长后可刮取到粉状菌体，反面呈黑褐色，产可溶性色素。菌株A2较A1生长缓慢，菌落细小，颜色较浅。正反颜色基本一致，不产可溶性色素。

由图5可知均有发育良好的分枝状气生菌丝，基内菌丝发达。孢子在镜检结果中呈透明状，A1可见成堆或排列成串的孢子，A2气生菌丝分枝较多，可见少量散落的或成串的孢子。由镜检结果和菌落形态初步鉴定A1、A2均为放线菌。

a-A1菌落图;b-A2菌落图图4 两株菌的菌落形态Fig.4 Colony morphology of 2 strains

a-A1气生菌丝;b-A2气生菌丝图5 两株菌气生菌丝镜检图(100×)Fig.5 Microscopic examination of aerial mycelium of the 2 strains

2.2.2 生理生化试验

本试验工作仅选取若干组与白酒酿造有一定相关性的理化特征进行试验，结果见表1。试验发现，菌株A1仅H2S的产生呈现阴性，其余试验均呈阳性，因此推测A1可能有产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶能力。A2仅淀粉水解呈现阳性，其余试验均呈阴性，由此推测菌株A2可能有产淀粉酶能力。这些酶可使原料中的大分子物质分解以供窖池中微生物进一步发酵利用。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)[30]和《链霉菌鉴定手册》[31]，菌株A1、A2符合链霉菌科链霉菌属生理生化特征。

表1 生理生化试验结果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments

2.2.3 16S rRNA基因测序及发育分析

将PCR反应原液送上海杰李生物技术有限公司进行纯化和测序，测序序列经NCBI数据库比对获取最高相似菌株序列，使用MEGA 7.0构建系统发育树。菌株A1、A2系统发育树结果如图6所示。菌株A1与streptomycessampsoniiNRRL B12325、streptomycessampsonii具有最大的序列相似性，达100%，发育树上处于同一个分支，将菌株A1鉴定为桑氏链霉菌(Streptomycessampsonii)，暂时命名为StreptomycessampsoniiA1。菌株A2与Streptomycesrutgersensisstrain NBRC 3727、Streptomycesrutgersensisstrain NBRC 3419具有最大的序列相似性，达99%，且发育树上处于同一个分支，我们将菌株A2鉴定为鲁地链霉菌(Streptomycesrutgersensis)，暂时命名为StreptomycesrutgersensisA2。

图6 邻接法构建的菌株A1、A2 16S rRNA序列系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain A1 and A2 16S rRNA constructed by adjacency method

2.3 放线菌的耐受性研究

2.3.1 放线菌耐酸性研究

菌株A1、A2的耐酸性结果见图7。显然，2株菌均在pH<4.3时生长受到抑制，在pH>4.3时生长良好。窖泥底层和下层的pH值在4.0～5.5，上层在5.5～6.5[29]，因此菌株A1、A2在窖内都具有一定的生存能力，但相比之下，A2对酸性环境更具有耐受性。本试验以无机酸调节pH，而窖泥自然环境中则主要为有机酸类，菌株在窖内可能具有更佳的耐酸性，但考虑到窖内的厌氧和高乙醇浓度，实际影响可能更为复杂。

2.3.2 放线菌乙醇耐受性研究

图8为A1和A2在不同浓度乙醇下的生长曲线。菌株A1在2%vol、4%vol、6%vol和8%vol的酒精度下均能生长，但有不同长度的延滞期(8%vol>6%vol>4%vol>2%vol)。而菌株A2不耐受8%vol的酒精度，在6%vol下可以缓慢生长，在4%vol和2%vol生长情况相近。总之，菌株A1、A2都可以耐受6%vol及以下的酒精度，酒醅中的酒精度一般在3%vol～6%vol[33]，所以2株菌在窖内的酒精环境下具有一定生存能力。

A-A1；B-A2图7 A1、A2的耐酸性生长曲线Fig.7 Growth curves of the strain of A1，A2 in the environment of different pH

a-A1；b-A2图8 A1、A2的乙醇耐受性生长曲线Fig.8 Growth curves of the strain of A1、A2 in the environment of different ethanol concentration

2.4 挥发性产物研究

2.4.1 菌株在液态培养条件下挥发性产物分析

经谱库NIST检索和资料分析，A1和A2在液态培养条件的产物分别见表2和表3。菌株A1在液态培养条件可产约35.030%的萜烯类物质，33.855%的土臭素(gesomin，GSM)以及5.721%的多菌灵类似物N-苯并咪唑-2-基氨基甲酸甲酯。此前，杜海从酿造环境中筛选出了5株产GMS菌株，鉴定均为链霉菌属[34]。菌株A2能够产生多种酯类，其中己酸乙酯具有较高的相对含量(5.384%)。同样地，A2在液态条件下能产萜烯类物质(3.327%)和多菌灵类似物(1.788%)，以及少量具有苦杏仁、樱桃及坚果香的苯甲醛。

表2 A1发酵液主要挥发性成分Table 2 The main volatile components of the fermentation broth of A1 strain

表3 A2发酵液主要挥发性成分Table 3 The main volatile components of the fermentation broth of A2 strain

2.4.2 菌株在固态培养条件下挥发性产物分析

经谱库NIST检索和资料分析，放线菌菌株A1、A2在固态培养条件下其主要挥发性产物分别见表4和表5。

表4 菌株A1燕麦醅主要挥发性成分Table 4 The main volatile components of the fermented Oatmeal of A1 strain

表5 菌株A2燕麦醅主要挥发性成分Tab.5 The main volatile components of the fermented Oatmeal of A2 strain

由表4可知，与液态培养条件下相比，菌株A1在固态培养条件下能产生更多种萜烯类物质,同样地能产较高含量的GSM,达5.64 ng/g。由表5可知，菌株A2在固态培养条件下，能够检测出大量醇类物质(51.08 ng/g)、酮类物质(44.60 ng/g)和吡嗪类物质(7.84 ng/g)，其中醇类物质以2,3-丁二醇为主，达(25.10±0.11) ng/g；酮类物质以3-羟基-2-丁酮为主，达(44.48±0.40)ng/g；吡嗪类以2,3,5,6-四甲基吡嗪为主，达(5.26±0.18)ng/g。2,3-丁二醇可转化为3-羟基-2-丁酮，因此A2产高含量的2,3-丁二醇，也一定程度上表明了会有高含量的3-羟基-2-丁酮[35]。此前，杜海[34]研究发现链霉菌会生成碱性的吡嗪类物质调节周围生产环境。总的来说，菌株A1在固、液态条件下都以产GMS和萜烯类物质为主，菌株A2在液态条件下具有较强产酯能力，在固态条件下主产酮类、醇类以及吡嗪类物质。与现有报道相比，挥发性产物含量不突出，但尚未见报道从浓香型窖泥中分离出主要产萜烯类、2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、四甲基吡嗪的放线菌。

3 讨论

本研究对窖泥样品的微生物群落结构进行分析，作为分离放线菌的参考和指导，分析结果扩大了窖泥放线菌的种属范围。采用原位培养法对放线菌进行分离，分离所得2株菌均为链霉菌亚目(Streptomycineae)，可能是由于试验仅挑取了有典型放线菌菌落特征的菌株，忽略了非典型的放线菌，也可能是由于原位培养装置只富集了仍有生长代谢活动的菌株，导致分离得到的菌株较少。

2株菌在固、液态培养条件下产物有较大差异，因为这些物质多为次级代谢产物，微生物具有多种次级代谢途径的潜能，不同培养基或者不同培养方式影响着菌株的次级代谢产物种类及含量[36]，如PUDER等[37]分别采用燕麦培养基和豆粉培养基获得试验放线菌的同种类型的不同化合物。从白酒中的美拉德反应[38]角度，菌株A1、A2在液态条件下生成的萜烯类物质，可与乙醇在醋酸的促进下生成原羰基化合物(醛、酮、羧酸及羧酸衍生物)，因此固态实验中，A1可生成多种酮类物质以及A2可生成多种酮类、醇类、吡嗪类物质可能是萜烯类物质转化而来。菌株A1产生的GSM与二甲基异茨醇(2-methyl isoborneol，MIB)是饮水中最常出现的土霉异味的2个主要来源[39]。GMS可引起白酒产生糠味，是影响清香型白酒风味主要原因[40]，因此在投入生产中应注意改善工艺，避免影响白酒风味。对于其产生的萜烯类物质，常见于植物的挥发油中，具有一定的药理功效[41]。菌株A2产生的3-羟基-2丁酮，又名乙偶姻，是一种重要的食用香料，具有强烈的奶油、脂肪样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气，是白酒的重要的香味成分[42]。其中2,3-丁二醇是一种重要的医药成分，在白酒中可单独用做香料，改善白酒风味，也可以转化为3-羟基-2-丁酮[35]。四甲基吡嗪是白酒中重要的香气化合物，且具有药理功能，被认为是中国白酒中的健康功能因子。有动物试验表明，四甲基吡嗪可以修复酒精引起的肝细胞损伤和脑神经损伤[43-44]。由此可见，菌株A2可深入研究，提高其物质产量后加以运用。

对于放线菌在浓香型白酒窖泥中的功能，研究还不够深入，但其应用前景很大，比如可用于生产人工窖泥等方面。在开发放线菌多种功能性产品的同时，需对菌种本身了解充分再加以利用，这还需要不断深入探究。