高静水压和热处理对荞麦蛋白功能性质的影响

周一鸣，杜丽娜，李云龙，周小理,，陈智东

（1.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418；2.山西省农业科学院农产品加工研究所，山西 太原 030031）

荞麦是亚洲和中东欧地区的传统作物，中国是世界荞麦的最大生产国。近年来，荞麦作为一种良好的功能营养食品原料越来越受到学界的关注[1]。荞麦蛋白（buckwheat protein，BWP）是荞麦中最主要的生物活性物质，其氨基酸组成均衡且富含人体限制性氨基酸——赖氨酸，其生物价相当于脱脂奶粉生物价的92.3%、鸡蛋全粉生物价的81.5%[2]，但由于荞麦中含有单宁、植酸和蛋白酶抑制剂，使得BWP具有较低的消化率，可以抑制体内脂肪的积累[3]。为此，部分学者对蛋白质的热加工和非热加工特性展开研究[4]，但对BWP热加工和非热加工后结构与乳化性的变化却鲜有报道。由于传统热处理法（heat treatment，HT）具有方法简便、设备投资少以及经热变性蛋白不易回复的特点，不仅可以部分提高蛋白质的功能特性，而且可以扩大食品原料的应用范围，成为国内较为普遍的食品加工方式[5]。随着消费者对食品营养功能的需求增大，促进了非热技术的研究与发展。高静水压（high hydrostatic pressure，HHP）处理作为一种非热加工技术的代表，能修饰蛋白质中的二、三、四级结构，即会通过影响蛋白质的氢键、离子键、疏水键等非共价键，从而改变蛋白结构，对影响食品营养成分、风味物质等的共价键却没有影响，故能最大限度地保持食品原有的风味和营养。且HHP处理能适用于一些热敏性物质，可以改善HT处理过程的种种缺陷[6]。郑环宇等[7]报道HHP处理（300～500 MPa、20 min）后大豆蛋白的抗原性降低了50%以上，与未处理蛋白相比，HHP处理后的大豆蛋白具有较高的疏水性。郭蔚波等[8]研究发现卵蛋白经HHP处理（400～700 MPa、20 min）后，其免疫反应性随着压力的增加而降低，蛋白质结构和功能特性（起泡性和乳化性）的变化与压力呈正相关。HHP技术在国外食品中的应用越来越广泛，其作为一种冷杀菌技术，具有比HT处理对食物营养和感官品质破坏较小等多种优势[9]。Sila等[10]以HHP和氯化钙对胡萝卜进行预处理，将预处理后的胡萝卜进行HT处理，并对质构变化进行动力学分析，结果发现经预处理后样品在HT处理过程中的软化现象得到抑制。此外，HHP还会影响果蔬类产品的流变特性，这种影响与压力和产品类型有关，与HT处理相比，经HHP处理后食品的黏度更大[11]。李兴武等[12]在研究HHP杀菌及超声波杀菌对红李果酱的营养成分和感官品质的影响中指出HHP杀菌后果酱色泽得到改善，感官评分最高。本实验采用HHP与HT处理（湿热处理和干热处理）两类不同的加工方式，通过对处理后BWP结构及功能性质变化进行研究，以选择能最大限度地保持或改善BWP品质的加工方式，为更好地利用BWP提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦粉购于山西雁门清高食品责任有限公司；BWP（粗蛋白质量分数62.95%）由实验室自制。

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸盐、8-苯胺基-1-萘磺酸、甘氨酸、三羟甲基胺基甲烷、三氯乙酸等（分析纯）购自国药集团（上海）化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

5L HHP 600 MPa高静水压设备包头科发高压科技有限责任公司；3-18K高速冷冻离心机美国Sigma公司；HH-4恒温水浴锅上海森地科学仪器有限公司；FTIR-850傅里叶变换红外光谱仪天津港东科技股份有限公司；UV-2600紫外-可见光分光光度计、RF-6000荧光分光光度计日本岛津公司；FD-80冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BWP的制备

参照王宏[13]的方法制备BWP。荞麦粉经石油醚脱脂24 h，自然风干，按料液比1∶10溶于蒸馏水中，用1 mol/L NaOH溶液调至pH 8，在4 ℃、50 r/min条件下磁力搅拌2 h，搅拌完成后5 000 r/min离心20 min，取上清液，用1 mol/L HCl溶液调至pH 4.5，取沉淀，冷冻干燥24 h，于4 ℃冰箱储存待测。

1.3.2 BWP的HT处理

湿热法：BWP与水按照料液比1∶10混匀，并置于恒温水浴锅中，温度100 ℃分别处理10、20、30 min，制得处理样品，冻干待用。

干热法：将BWP平铺在搪瓷盘上，置于事先预热的烘箱中，温度100 ℃分别处理10、20、30 min，然后取出待用。

1.3.3 BWP的HHP处理

提前打开HHP的水浴循环装置预热至20 ℃，并将10 g BWP溶于100 mL蒸馏水中再进行真空包装处理。随后将真空包装的样品放入HHP处理腔中，压力分别设置为100、300、500 MPa，保压时间分别设置为10、20、30 min，泄压过程在3 s内完成，以未处理样品（0.1 MPa）作为空白对照组，取出样品进行冷冻干燥后贮存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.4 对BWP功能性质的测定

BWP溶解性参考Martínez等[14]的方法测定；起泡性及泡沫稳定性参考宋永令等[15]的方法测定；乳化性及乳化稳定性参考朱雪萍等[16]的方法测定。

1.3.5 BWP氧化指标的测定

BWP羰基参考郭丽萍等[17]的方法测定；巯基含量参考Grigera等[18]的方法测定；表面疏水性参考Zhao Feng等[19]的方法测定。

1.3.6 BWP二级结构分析

BWP二级结构参考Linsberger-Martin等[20]的方法采用傅里叶变换红外光谱进行分析。

1.4 数据处理与分析

实验重复3 次，取其平均值，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件处中Duncan法进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。同时，采用Origin Pro 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 HHP处理和HT处理对BWP功能性质的影响

2.1.1 HHP处理和HT处理对BWP溶解性的影响

溶解性是蛋白质水化作用的重要体现，溶解性对蛋白质乳化性、起泡性、凝胶作用等功能性质也具有影响。Cabanillas等[21]认为，蛋白质溶解性与氨基酸残基的平均疏水性和电荷频率有关。

图 1 HHP处理和HT处理对BWP溶解性的影响Fig. 1 Effect of HHP treatment and HT on solubility of BWP

从图1中可以看出，不同处理方式均可使BWP溶解性发生变化，其中，压力达到100 MPa以上时，蛋白质溶解性均会有所提高，尤其是500 MPa HHP处理30 min时，BWP的溶解性达到最大值（65.5%），较空白对照组增加26.6%（P＜0.05）；湿热与干热处理也分别在30 min和10 min时溶解性增加46.10%和39.10%。但HHP与HT处理的加工原理有所不同，HT处理（干热、湿热）是通过破坏蛋白质的水合作用而增加溶解性，为不可逆过程；HHP处理则是使球状蛋白从凝聚状态通过分子解聚和伸展形成更小的亚基单位，从而释放出内部的极性基团和疏水基团，使蛋白质分子的表面电荷数量增多、结合水增多，从而改善了溶解性，因此从保持或改善BWP溶解性以及节约时间的角度出发考虑，可以选择湿热处理（100 ℃、10 min）的方式对BWP进行加工。

2.1.2 HHP处理和HT处理对BWP起泡性及泡沫稳定性的影响

蛋白质若要具备起泡剂的性能则必须能在气-液界面快速降低表面张力，通过分子间相互作用形成黏弹性膜并且易于在界面上展开和重排。特别是对于一些起酥性食品和发泡型饮料（如蛋糕、冰淇淋和啤酒等），这一性质尤为重要。

图 2 HHP处理和HT处理对BWP起泡性及泡沫稳定性的影响Fig. 2 Effect of HHP treatment and HT on foaming ability and foam stability of BWP

从图2中可以看出，HHP处理可以提高BWP的起泡性和泡沫稳定性，当压力为500 MPa、时间为30 min时二者均达到最大值（91.5%和50.1%）；而HT处理会降低BWP的起泡性和泡沫稳定性，且BWP的起泡性和泡沫稳定性并未随加热时间的延长而发生明显的变化。这可能是由于HT处理会导致蛋白质分子解聚、疏水性增强、分子柔性增大，对维持蛋白质的泡沫稳定性不利，且随着HT处理温度的升高，蛋白质聚集沉淀、黏度下降，使得BWP无法进行分子间相互作用，导致其不易在气-液界面上展开和重排，从而降低起泡性和泡沫稳定性[22-23]。HHP可以改变蛋白质的三、四级结构，使得蛋白质更容易形成空气与水的界面，同时由于极化作用使得蛋白质分子展开，形成了更加稳定的网络结构以及更加稳固的界面膜，从而增强了BWP的起泡性和泡沫稳定性。因此，从保持起泡性及泡沫稳定性的角度考虑，可以选择HHP（500 MPa、10 min）对BWP进行加工。

2.1.3 HHP处理和HT处理对BWP乳化性及乳化稳定性的影响

HHP处理可以促使蛋白质中的极性分子和水分子运动，使蛋白质的亲水性和亲油性提高，增加了蛋白质之间的相互作用，进而改善BWP的乳化性[24]。乳化性在食品的加工过程中具有重要作用，具有良好乳化性的食品拥有良好的口感。

图 3 HHP处理和HT处理对BWP乳化能力及乳化稳定性的影响Fig. 3 Effect of HHP treatment and HT on emulsifying ability and emulsion stability of BWP

从图3中可以看出，BWP的乳化性以及乳化稳定性均随着HHP压力的增加而总体得到改善，尤其在500 MPa、30 min时达到最大值（67.3 m2/g），较空白对照组升高16.1 m2/g，而HT处理显著降低了BWP的乳化性及乳化稳定性（P＜0.05）。这可能是由于HT处理会导致蛋白质过度变性，产生许多的聚集体，使分子的溶解性降低，而少数蛋白质分子则可以在短时间内扩散到油-水分界面，从而导致其乳化效果明显下降[25]。但随着HHP处理压力的增加，可溶性多肽含量增加，更多的蛋白质可以吸附在液滴油-水表面，使液滴絮凝桥联程度降低，从而增加蛋白质的乳化性[26]，且HHP处理促进了蛋白质中极性分子和水分子的运动，改变了亲水基团与亲油基团的数目和比例，进而改善BWP的乳化性及乳化稳定性[27]。因此，为保持B W P 的乳化性，可以选择H H P 处理（500 MPa、10 min）进行BWP加工。

2.2 HHP处理和HT处理对BWP氧化程度的影响

2.2.1 HHP处理和HT处理对BWP羰基含量的影响

羰基含量是评价蛋白质氧化程度的一个重要指标[28]。羰基含量的变化在一定程度上可以反映出蛋白质的氧化程度。从图4中可以看出，两类处理方式均可使BWP的羰基含量显著增大（P＜0.05）。HT处理10 min羰基含量就已经超过了500 MPa HHP处理30 min时所达到的最大值（4.90 mmol/L）。这可能是由于HT处理过程中，蛋白质结构发生变化，导致蛋白变性，细胞膜结构被破坏，造成铁及其他过渡金属离子的释放，一些亚铁血红素和各种氧化酶可能会作为产生活性氧和非氧自由基的催化剂[29]。这些自由基会攻击BWP，对BWP氧化起到很强的催化作用，导致BWP羰基含量升高。羰基含量明显上升也可能是HHP处理导致易氧化的成分暴露于氧气中，从而加速氧化过程，同时，随着压力的上升，自由基不断释放，导致氧化速率加快，羰基含量增加[30]。

2.2.2 HHP处理和HT处理对BWP巯基含量的影响

HHP处理可使巯基基团暴露在分子表面，使其与空气中的氧气结合，形成二硫键，它的生成可以降低蛋白质的构象熵，使蛋白质结构变得稳定，从而赋予食品良好的热稳定性[31-32]。且二硫键在维持蛋白质的食品功能性质中起重要作用，如面筋[33]、凝胶的形成[34]和蛋白质的成膜[35]等。

图 5 HHP处理和HT处理对BWP巯基含量的影响Fig. 5 Effect of HHP treatment and HT on sulfhydryl content of BWP

从图5中可以看出，不同处理方式均可使BWP的巯基含量发生变化，其中HT处理会明显增加BWP的巯基含量，但随着HT处理时间的延长，巯基含量略有下降，干热处理100 ℃、30 min时巯基含量相对较低，但仍高出空白对照组2.76 μmol/L。而HHP处理则会降低BWP的巯基含量，且随着HHP压力的增大，BWP的巯基含量逐渐减少，尤其在500 MPa、30 min的处理条件下达到最小值（6.9 μmol/L），较空白对照组减少3.1 μmol/L。这可能是因为在热变性温度下蛋白质聚集体发生部分解离，暴露出二硫键，促使二硫键含量升高。而HHP处理能够使蛋白酶的游离巯基含量增加，分子构象趋于去折叠态，致使巯基含量减少。苏丹等[36]在研究HHP处理大豆分离蛋白时同样发现与本实验较为类似的现象，大豆分离蛋白的巯基含量在200 MPa的处理条件下略有提高，但在压力为500 MPa时达到最小。

2.2.3 HHP处理和HT处理对BWP表面疏水性的影响

表面疏水作用在维持蛋白质的三级结构的稳定和四级结构的形成中占有突出地位[37]。疏水作用对蛋白质的稳定性、构象和蛋白质功能具有重要意义[38]。

图 6 HHP处理和HT处理对BWP表面疏水性的影响Fig. 6 Effect of HHP treatment and HT on surface hydrophobicity of BWP

从图6中可以看出，与未经处理的BWP相比，不同条件处理后BWP的表面疏水性发生了明显改变。其中，BWP经500 MPa HHP处理20 min后由于暴露出更多的疏水性区域，其表面疏水性达到最大，较空白对照组增加约1 倍，表明BWP的三级和四级结构经HHP处理后发生了变化。而经HT处理的BWP表面疏水性低于空白对照组。这可能是随着HT处理时间的延长，蛋白亚基之间会形成可溶或不可溶的聚集体，使暴露的疏水键和共价键相互作用，导致蛋白质发生严重的热聚集，屏蔽了蛋白质的疏水区，减少了荧光探针结合的疏水基团，使得BWP的表面疏水性下降[39]。Kajiyama等[40]研究发现大豆蛋白在HHP处理下随着压力的增加表面疏水性上升。产生该现象的原因可能是HHP处理破坏了蛋白质分子中的弱氢键和范德华力，从而使蛋白质分子的结构发生改变，疏水基团暴露[41]。

2.3 HHP处理和HT处理对BWP二级结构的影响

傅里叶变换红外光谱分析是分析蛋白质二级结构常用的方法之一，一般蛋白质在红外光谱中被研究较多的是位于1 600～1 700 cm-1处的酰胺I带、1 530～1 550 cm-1处的酰胺II带和1 260～1 330 cm-1处的酰胺III带[42]，BWP在相同时间下经HHP处理和HT处理的傅里叶变换红外光谱如图7所示。

图 7 HHP处理和HT处理BWP的傅里叶变换红外光谱图Fig. 7 FTIR spectra of BWP subjected to HHP treatment and HT

表 1 HHP处理和HT处理后BWP二级结构含量Table 1 Contents of secondary structures in BWP subjected to HHP treatment and HT

随着HHP处理压力的增加和时间的延长，红外光谱峰形发生了不同程度的改变，说明蛋白质二级结构发生了变化。其中酰胺I带主要由蛋白多肽骨架的C＝O伸缩振动引起，吸收强度最强，是蛋白质二级结构变化的敏感区域，同时也与N—H的平面扭曲和C—N的伸缩振动有关[43-44]。利用Peak fit 4.12软件对HHP处理产物的酰胺I带采用去卷积二阶导数拟合出蛋白二级结构含量，如表1所示。蛋白质的二级结构主要以β-折叠和β-转角为主，且HHP处理后无规卷曲、β-转角、β-折叠和α-螺旋的相对含量均发生了显著的变化（P＜0.05），与未经HHP处理的BWP相比，HHP处理后的样品二级结构中α-螺旋和β-折叠相对含量减少，β-转角和无规卷曲相对含量有所增加，说明HHP处理导致BWP的二级结构发生了变化。其可能的原因是HHP处理后，—OH伸缩振动的特征吸收峰发生了红移，导致蛋白质分子内氢键断裂，且部分α-螺旋和β-折叠结构在HHP后转变为无规卷曲[45]。HT处理使BWP变性，蛋白质分子亚基解离，有序结构舒展解折叠，导致β-转角和无规卷曲相对含量也有所增加，但不显著。

2.4 HHP处理BWP氧化程度与功能性质间相关性分析结果

表 2 HHP处理BWP氧化程度与功能性质相关性分析Table 2 Correlation analysis between structural and functional properties of BWP treated by HHP

对HHP处理后的BWP氧化程度与功能性质进行相关分析，由表2可知，经HHP处理后BWP的溶解性与乳化性、起泡性、羰基含量、巯基含量之间均存在一定的相关性。蛋白质的乳化能力对食品品质极为重要，且与溶解性成反比，一旦乳状液形成，不溶性的蛋白质即起到稳定乳状液的作用。其中，BWP的乳化性与起泡性、表面疏水性呈显著正相关，同时与巯基含量呈极显著负相关，与乳化稳定性、泡沫稳定性、羰基含量相关性不显著；乳化稳定性与泡沫稳定性和表面疏水性呈显著正相关。BWP的泡沫稳定性与乳化稳定性、起泡性、表面疏水性呈显著正相关，相关系数大于0.9。说明蛋白质的表面疏水性变化和溶解性的升高是由蛋白氧化引起的，从而使蛋白质的结构发生改变，并且巯基-二硫键含量的变化与其功能特性的关系最为显著，表面疏水性对蛋白质的泡沫稳定性与抗氧化性改善起到了重要作用。

3 结 论

不同的处理方式（HT和HHP）均会对BWP功能特性产生影响，但由于HT（干热、湿热）破坏了蛋白质的结构，对于食品的营养成分和感官品质破坏较大，而HHP处理解决了这一问题，它对食品的营养成分和感官品质影响较小，对生物大分子的共价键无影响，仅对非共价键（疏水键、离子键和氢键等）进行破坏。其中，HHP处理随着压力的增加和时间的延长，BWP的乳化性、起泡性均显著增加，且在30 min、500 MPa时分别达到最大为67.3%和91.5%，BWP巯基含量显著下降（P＜0.05），疏水性和羰基含量显著增大（P＜0.05），说明HHP处理具有提高蛋白质乳化性、起泡性等功能性质的作用。傅里叶变换红外光谱分析结果表明HHP处理后BWP的α-螺旋和β-折叠有序结构相对含量降低，无规卷曲相对含量增加，且暴露出更多的疏水性区域，引起蛋白中的构象表位被破坏或掩盖，从而导致乳化性的改变。HHP处理后BWP氧化程度与功能特性相关性分析表明，表面疏水性的变化与其功能特性的关系最为显著。BWP的表面疏水性和巯基含量呈显著负相关（P＜0.05），与起泡性、乳化性呈显著正相关（P＜0.05，P＜0.01），说明表面疏水性的变化可以引起蛋白乳化性的变化，进而改变蛋白质的结构。在HT处理过程中，随着加热时间的延长，BWP的溶解性显著升高（P＜0.05），BWP的羰基含量与溶解性呈极显著正相关（P＜0.01），而与乳化性、乳化稳定性、起泡性、泡沫稳定性呈负相关，表明蛋白质的氧化对BWP的功能特性具有影响。