丹参提取物对放射性肺损伤大鼠的保护作用研究

陈岩岩 周淑娟 夏玉朝 薛晓拉

放射性肺损伤(Radiation-induced Lung Injury，RILI)是乳腺癌、肺癌、食管癌等胸部肿瘤放疗中最为普遍和严重的并发症。当胸部照射剂量超过肺组织阈值时，会损伤肺组织，初期主要是炎症发生，后期迁延加深会导致纤维化的发生[1]。放射性肺炎(RP)是RILI的早期表现，在高剂量照射后的3个月后即可发生急性RP；放射性肺纤维化(RF)是RILI的晚期表现，通常在数个月或数年后出现，时间界限不等。目前，急性RP的发生率高达5%～30%。RILI严重影响肿瘤靶区的照射剂量，减低肿瘤局部控制率，对肿瘤的放疗效果影响巨大，轻则导致放疗中断，严重者可引起肺功能衰竭而死亡[2]。RILI是多种因素综合调控的的复杂过程，西医治疗效果不甚理想。中医认为RILI从属“火热毒邪”、“燥邪”，总结其病机总属为火热之邪或燥邪损伤血络，耗伤气阴，火热蕴结，以养阴、活血及清热解毒为主要方法[3]。临床研究证实[4]， 中药提取物对放射所导致的肺损伤具有一定的效果，同时具有保护肺组织、滋阴清肺的作用，副作用小。丹参是传统上治疗心血管疾病的主要药物，现代研究发现其还具备抗菌、抗炎、抗肿瘤、保护器官等作用[5]。本次研究就丹参提取物(丹参酮和丹酚酸类)对放射性肺损伤大鼠的作用进行研究和观察，探讨其在预防及控制放射性肺损伤中的作用机制报告如下。

资料与方法

一、实验仪器和材料

HM-MD-I放射治疗模拟机、HM-J-16-I中高能双光子医用电子直线加速器购自江苏海明医疗器械有限公司；电脑半自动石蜡切片机购自浙江金华惠友仪器有限公司；ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司(ABI)；显微镜购自上海测维光电技术有限公司；赛默飞世尔(Thermo Scientific)酶标仪、移液器购自上海沃元科技有限公司；TG16台式高速离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；生理盐水、二甲苯、多聚甲醛、无水乙醇、10%水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司；ELISA试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物工程研究所；

二、实验动物

共90只无特定病原体(SPF级)8周龄雄性SD大鼠，体重(195±15)g由省动物实验中心提供。所有大鼠分笼饲养，由专人负责管理。实验室定期消毒，环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。饲养1周无异常后开始实验，所有操作均遵循《实验动物保护条例》。

三、方法

1 分组方法和模型制备 将所有实验大鼠随机分为3组，每组各30只。A组为空白对照组，不进行照射；B组为单纯照射组；C组为照射加丹参提取物组。B、C组大鼠取仰卧位，10%水合氯醛麻醉，四肢固定，充分暴露胸部进行照射，避免其他部位暴露。照射剂量12Gy，照射范围为大鼠右侧胸部，包括大鼠前肢两腋窝中点连线至剑突水平。分别在X线照射4周、8周、12周后各取10只大鼠心脏采血后处死、取材。

2 丹参提取物制备 丹参药材由医院中药房提供，切断成片状后使用75%乙醇回流提取丹参，质量比为10 ∶1，提取时间为15 min，重复提取3次。合并滤液后得到丹参提取液，减压回收溶剂得到无醇味浸膏，蒸馏水洗涤10次左右后喷雾干燥，获得丹参提取物。

3 给药方法 A、B组大鼠按照体质量给予生理盐水灌胃，标准为1.5 mL/200 g，使用适量盐水将丹参提取物配比为悬浮液，C组以相同标准给予丹参提取物灌胃。连续灌胃1周后，B、C组给予X线照射。照射后各组继续按上述方法灌胃2周，期间观察大鼠活动情况并按周对大鼠体质量进行称重，根据体质量调整灌胃剂量。

4 样本采集和检测方法 10%水合氯醛麻醉后心脏穿刺取血5 mL。血液样本置于肝素抗凝管内，3 000 r/min离心分离15 min，取上清液低温保存，待全部取材后同时进行检测。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清学指标[6]：白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、生长转化因子β(TGF-β1)。开胸后清除胸肋骨，使胸腔完全暴露，迅速摘取肺组织，取右上肺组织，0.9%生理盐水冲洗干净，10%甲醛溶液固24 h，石蜡包埋，常规切片后HE染色观察病理改变。采用ELISA法检测S0D含量，硫代巴比妥酸化学比色法测定MDA含量。右肺系数=肺湿重(mg)/体质量(g)×100%，肺系数越高表示肺纤维化程度越高。采用荧光定量PCR检测NF-κB水平，提取肺组织RNA，逆转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR仪进行扩增。2-△△cT法计算目的基因相对表达量，引物序列如下： NF-κB p65上游：5′-AACAACACAGACCCAGGAGT-3′，下游：5′-CTGTCACCAGGCGAGTTATAG-3′Ⅲ。

四、观察指标

① 血清学指标：IL-6、TNF-α、TGF-β1；② 大鼠血清SOD活性变化；③ 大鼠右肺系数；④ 大鼠肺组织MDA含量；⑤ 大鼠肺组织NF-κB p65表达。

五、统计学方法

结 果

一、血清学指标变化比较

B组和C组大鼠照射4周、8周、12周后血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明显高于A组(P<0.05)；C组血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 各组IL-6、TNF-α、TGF-β1表达变化比较

二、肺组织SOD活性变化比较

B组和C组大鼠照射4周、8周、12周后肺组织SOD活力与A组相较有明显下降(P<0.05)；C组大鼠各期肺组织SOD活力明显高于B组(P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠肺组织SOD活性变化比较

三、肺组织MDA含量比较

B组和C组大鼠照射4周、8周、12周后肺组织MDA含量与A组相较有明显提高(P<0.05)；C组大鼠各期肺组织MDA含量明显低于B组(P<0.05)(见表3)。

表3 各组大鼠肺组织MDA含量比较

四、右肺系数比较

4周、8周后，与B组比较，C组大鼠右肺系数比B组有明显下降(P<0.05)；12周后3组大鼠右肺系数比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 各组大鼠右肺系数比较

五、肺组织NF-κB p65相对表达量比较

B组和C组大鼠照射4周、8周、12周后肺组织NF-κB p65相对表达量与A组相较有明显提高(P<0.05)；C组大鼠各期肺组织NF-κB p65相对表达量明显低于B组(P<0.05)(见表5)。

表5 各组大鼠肺组织NF-κB p65相对表达量比较

讨 论

恶性肿瘤的发病率不断上升导致越来越多的患者进行放射治疗，因此带来的RILI对患者的健康和生活质量的严重影响逐渐获得重视。关于RILI的发病机制目前尚未完全明确，其发生与多种细胞因子如IL-6、TNF-α、TGF-β1等密切相关，因此“细胞因子级联”学说是当前比较认可的一种学说。RILI可分为早期RP和晚期RF，晚期RF一旦形成会造成不可逆的损伤，严重影响患者健康，威胁患者生命。由此可见，预防和放射前提前用药干预比后续治疗效果更佳。

多种研究显示[7-8]，RILI的发生是炎性细胞、肺泡上皮细胞和成纤维细胞，多种细胞因子共同作用而导致，对于细胞IL-6、TNF-α、TGF-β1等多种细胞因子的研究能够较好的体现放射性肺纤维化的发生、发展的过程。因此对于IL-6、TNF-α、TGF-β1的监测对于RILI具有很好的预测作用。西医对于RILI的治疗一般给予吸氧、止咳、平喘等对症治疗，急性期症状严重者给予肾上腺皮质激素治疗，但未能取得很好的治疗效果，且无法发挥预防作用。在中医理论中，RILI应属于肺痿、喘证的范畴，整体表现为骨髓抑制、免疫功能下降、肺组织纤维化，局部表现为喘息、咳嗽、呼吸困难等症状[9]。研究证实[10]，中医药对于相关致炎和致纤维化因子的表达有明显抑制作用，可减轻放射性肺损伤急性期的炎症反应，延缓放射性肺损伤纤维化的进展。本文主要针对丹参提取物对放射性肺损伤大鼠的保护作用展开研究。

丹参是我国传统中药，味苦，微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功。现代中医药研究表明，丹参具有抗炎、保护血管内皮细胞、减轻细胞凋亡、促进组织修复与再生，抗纤维化等作用。脂溶性的二萜醌类化合物以及水溶性的酚类成分是丹参主要化学成分。丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮及其异构体为脂溶性成分，原儿茶醛、丹参素、迭香酸、丹参酚酸等为水溶性成分。

有学者研究发现，在抗纤维化作用方面，丹参对鸡胚绒毛尿囊膜及转基因斑马鱼新生血管的活性具有很好的抑制作用，并且对血管内皮细胞功能有很好的调节作用。对丹参提取物的检测发现，丹酚酸B增加了血清清除自由基(SOD)能力，降低了脂质过氧化副产物(MDA)水平[9]。SOD具有清除机体内过多的超氧负离子自由基的能力，检测组织中SOD的活力水平能够了解机体组织对氧化物、自由基等的清除能力。机体内MDA的含量可间接反映体内S0D活力，反映体内脂质氧化程度，了解机体氧化一抗氧化系统能力。本次研究结果显示，C组SOD活性水平明显高于B组，MDA含量明显低于B组(P<0.05)，与其他学者研究结果基本一致[11]。IL-6是具有代表性的炎性因子，具有增强NK细胞活性、诱导急性期反应分子并刺激肝细胞的作用；TNF-α是一种强力促炎性反应细胞因子，作为体内细胞因子调解启动因子在刺激炎性细胞趋化反应、改变血管内皮通透性等方面发挥强大的局部作用；TGF-β1由多种细胞分泌产生，能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，现已成为RILI防治的新靶点，多种研究均表明干预TGF-β1信号通路能够减轻RILI的发生，降低血清中TGF-β1的水平对于RILI的防治具有重要作用[12]。本次研究结果表明，C组血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示丹参提取物能够有效减轻炎性反应、抑制纤维化。NF-κB 作为核转录因子，在炎症反应的发生和发展过程中具有十分重要的调控作用，能够经由降低 NF-κB的转录来对肺损伤以及肺纤维化产生抑制作用[13]。本次研究结果显示，C组大鼠各期肺组织NF-κB p65相对表达量明显低于B组(P<0.05)，提示丹参有效降低NF-κB p65的转录，为RILI患者提供保护。通过对各组大鼠不同阶段右肺系数的对比发现，丹参提取物能够降低实验大鼠右肺指数，从而降低肺部病理损伤，最终发挥抗纤维化的作用。

通过上述研究总结，丹参提取物对RILI的机理主要有：①保护血管内皮细胞，改善血液循环，降低血管通透性，抑制血小板聚集，减轻肺水肿和纤维化的发生；②抑制TNF-α、TGF-β1等表达，减轻炎症及纤维化病变；③增强抗氧化和清除自由基作用，降低射线引起的过氧化损伤，抑制成纤维细胞增殖。但是丹参酮类化合物具有脂溶性高、半衰期短和生物利用度低等缺点[14]，临床应用受到限制。

综上所述，丹参提取物对RILI具有良好的保护作用，能够显著降低血清IL-6、TNF-α、TGF-β1水平，提高血清SOD活性水平，降低肺组织织MDA含量、NF-κB p65表达和右肺系数，减少相关炎症的发生，预防肺纤维化。