LC-MS/MS 法测定口含烟中的4 种亚硝基氨基酸

王冰，余晶晶，蔡君兰，王昇，刘克建，赵晓东，刘绍锋，秦亚琼，谢复炜，王晓瑜

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开封区枫杨街2号 450001

口含烟是一种重要的新型烟草制品，不产生烟气，又能满足尼古丁摄入的需求。随着全球控烟形势的日趋严峻，口含烟因其独特的使用方式逐渐成为烟草消费的重要补充形式以及国际烟草领域的重要发展趋势[1-4]。目前市场上的口含烟主要有3 类产品形式，分别为湿含烟（美式湿含烟Moist snuff /瑞典含烟Snus）、含化型制品、胶基型制品；其核心成分仍然是烟草（包括烟丝、烟草碎片、烟草颗粒及烟末等）或烟草关键成分（如烟碱、烟草香味物质等）提取物[5-6]。

在烟草加工过程和卷烟燃烧过程中共有4 种类型的亚硝胺生成，它们包括：挥发性亚硝胺（VANs）、烟草特有亚硝胺（TSNAs）、非挥发性亚硝胺和N-亚硝基氨基酸[7]。目前国内外展开了大量关于TSNAs测定及形成机理的研究[8-9]，挥发性亚硝胺方面也有文献报道[10-11]，但在国内尚未有烟草中亚硝基氨基酸方面的研究。

亚硝基氨基酸是由烟草中的氨基酸以及带有仲氨基的蛋白质发生亚硝化反应生成的。截止目前，口含烟中共有11 种N-亚硝基氨基酸被测定出来，而其中4 种N-亚硝基肌氨酸（N-Nitrososarcosine，NSAR）、3-（N- 甲基亚硝基氨基） 丙酸（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid ，MNPA）、4-（N-甲基亚硝基氨基）丁酸（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA）、亚硝基氮杂环丁烷-2-羧酸（Nitrosoazetidine-4-carboxylic acid ，NAzCA）在动物实验中被确认为致癌物，可诱发小鼠肝癌、肺癌、膀胱癌、食道癌，被IARC 列入无烟气烟草制品28 种有害物质名单之中[12-13]。国外对口含烟中N-亚硝基氨基酸的文献报道主要集中在1985 年到1999 年[14-21]，主要采用重氮甲烷衍生-气相色谱-TEA 方法对口含烟中N-亚硝基氨基酸含量及随存贮条件的变化进行了研究；重氮甲烷具有毒性、容易爆炸，且操作过程极为繁琐。1989 年，James 等研制了液相色谱与化学发光检测器的接口[22]；1999 年，Cheng 等尝试使用离子对试剂高效液相色质谱检测NSAR、NPRO、NTCA 及NMTCA 四种亚硝基氨基酸[23]，从而为烟草中亚硝基氨基酸的分析提供了新的思路。

本文针对口含烟中重点关注的NSAR、MNPA、MNBA 及NAzCA，通过对前处理条件和仪器方法的优化，建立了一种简单、定量准确的LC-MS-MS 分析方法。为了减少亚硝基氨基酸对口含烟吸食者健康可能造成的伤害，控制它们在口含烟中的含量提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

14 种市售口含烟样品。样品信息如表1 所示。

表1 14 种市售口含烟样品信息Tab.1 Informations of 14 kinds of commercially available oral tobacco samples

标准品：N-亚硝基肌氨酸（N-Nitrososarcosine，NSAR）、3-（N- 甲基亚硝基氨基） 丙酸（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid，MNPA）、4-（N- 甲基亚硝基氨基） 丁酸（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA）、亚硝基氮杂环丁烷-2- 羧酸（Nitrosoazetidine-2-carboxylic acid，NAzCA）；N- 亚硝基肌氨酸-d3（N-Nitrososarcosine，NSAR- d3）、3-（N- 甲 基亚硝基氨基） 丙 酸-d3（3-(N-methylnitrosamino) propionic acid，MNPA-d3）、4-（N- 甲基亚硝基氨 基） 丁 酸-d3（4-(N-methylnitrosamino) butyric acid，MNBA-d3）、亚硝基氮杂环丁烷-2-羧酸-d5（Nitrosoazetidine-4-carboxylic acid，NAzCA-d5）（纯度≥98%，上海安谱公司）。

试剂：乙腈（色谱纯，美国Dikma 公司）；乙酸（色谱纯，美国Tedia 公司）；乙酸乙酯（色谱纯，美国Dikma 公司）；甲酸（色谱纯，美国Tedia 公司）。

净化柱：BIOTAGE isolute SLE（5mL）。

仪器：API55000 质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； Milli-Q50 超纯水仪（美国MILLIPORE 公司）；KQ-700DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP2245 电子天平（感量：0.0001 g，德国Sartorius 公司）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI）。

1.2 样品前处理

对于胶基型口含烟，先称取1 g 样本，加入1 mL正己烷分散样本；对于美式湿含烟、瑞典含烟含化型制品，直接称取1 g 或1 袋于50 mL 萃取离心管中。加入10 mL 含有内标的去离子水，于2500 rpm 下，涡旋30 min，取萃取液5 mL，加于ISOLUTE 硅藻土固相支撑液液萃取柱（BIOTAGE isolute SLE），用30 mL 乙酸乙酯（含2%乙酸）分三次洗脱，每次10 mL，收集洗脱液，45℃下浓缩至干，用0.5 mL 去离子水复溶、混匀。混匀后进LC-MS/MS 分析。分析条件见表2。

色谱柱：Waters Atlantis® T3 分析柱（150 mm ×2.1 mm，3.0 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A：0.1%（v/v）甲酸水溶液，B：乙腈溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脱条件见表2；分析时间：5 min；进样体积：5 μL。离子源：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：-4500 V；气帘气压力：30 psi；辅助气1 压力：60 psi；辅助气2 压力：60 psi；离子源温度：500 ℃；各化合物的定量离子对、定性离子对、驻留时间、碰撞能量（CE）及去簇电压（DP）参见表3。

表3 亚硝基氨基酸质谱检测参数Tab. 3 Determination parameters of N-nitrosamino acids by mass spectrometry

2 结果

四种亚硝基氨基酸的结构式如图1 所示，可知亚硝基氨基酸中，氨基上的氮原子分别形成N-C、N-N共价键，常规分析氨基酸的氨基所发生的衍生反应，亚硝基氨基酸很难发生，因此，本实验选择直接分析亚硝基氨基酸原型。

图1 4 种亚硝基氨基酸结构式Fig. 1 Structural formulas of four N-nitrosamino acids

2.1 色谱柱的选择

4 种亚硝基氨基酸目标物均为水溶性极性小分子，实验中首先考虑了亲水作用色谱柱Agilent HILIC Plus（100 mm×2.1mm，3.5 μm）的分离效果，发现HILIC 柱子并不能很好的保留四种亚硝基氨基酸。四种亚硝基氨基酸的保留时间均在1.5min左右。

为达到好的分离效果，选取五种高比例水相耐受柱Agilent ZORBAX SB-AQ （100 mm × 2.1 mm，3.5 μm），Agilent ZORBAX BONUS-RP （100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm），Agilent Proshell 120 EC-C8（100 mm × 3.0 mm，2.7 μm），Waters Atlantis ® T3（150 mm × 2.1 mm，3 μm），Thermo Accucore PFP（150 mm × 2.1 mm，2.6 μm）进行了对比实验。4 种目标物在5 种分析柱上的分离效果如图2 所示。在PFP 和SB-AQ 柱上保留比较差，出峰均在2 min 前；BONUS-RP 柱子对NSAR、NAzCA 保留效果好，但NSAR 出双峰，NAzCA 的灵敏度差，响应较低，而对MNPA、MNBA 保留效果差；EC-C8 与T3 柱子对4 种目标物的保留效果相似，出峰均在2 min以后，考虑到T3 柱子可以耐受100%水相，通过调整流动相可以进一步调高目标物在色谱上的分离度，实验重复性会更好，因此选T3 柱子为最终实验用色谱柱。

2.2 流动相条件的优化

2.2.1 流动相的确定

为了得到最好的峰型和响应值，对流动相和洗脱梯度条件进行了优化。采用乙腈为流动相B，分别采用0.1%甲酸水溶液，5 mmol/L 甲酸铵水溶液、1%甲酸水溶液为流动相A 进行试验。

研究结果表明，流动相A 中加入一定比例的甲酸铵有助于亚硝基氨基酸化合物的离子化，质谱响应高，但出峰时间快，4 种化合物保留时间短，影响口含烟样品中4 种目标化合物的测定。流动相A 中加入一定比例的甲酸，亚硝基氨基酸的响应较加入甲酸铵时低，但并不影响样品中目标物的定量，而且加入一定比例的甲酸能显著提高目标物在色谱柱上的保留，使样品中4 种目标化合物得到有效分离, 实验结果如图3 所示。当甲酸比例由0.1 %增加至1 %时，保留时间没有显著延长，质谱响应稍降低；因此选用0.1%的甲酸水溶液为流动相A。

图2 4 种亚硝基氨基酸在5 种色谱柱上的保留Fig.2 Retention of four N-nitrosamino acids on five chromatographic columns

图3 流动相中添加甲酸铵和甲酸对4 种亚硝基氨基酸保留的影响Fig.3 Effects of ammonium formate and formic acid on retention of four N-nitrosamino acids in mobile phase

2.2.2 流动相梯度条件优化结果

采用口含烟实际样品对流动相梯度条件进行优化，最终条件如表2 所示。在实验条件下，标样、及样品中目标化合物均得到基线分离，峰形良好，分离色谱图见图4。

图4 标样(A)及样品(B)中四种亚硝基氨基酸色谱质谱图Fig.4 Chromatogram mass spectrometry of four N-nitrosamino acids in standard sample(A) and tobacco sample(B)

2.3 质谱条件的确定

在正离子模式、负离子模式下以流动注射的方式对各分析物的标准溶液（5 μg/mL）进行全扫描，结果表明：目标物在负离子模式下响应远高于正离子模式下响应。因此选择负离子模式对目标物进行分析，确定了各分析物的母离子（[M-H]-），然后分别以[M-H]-选择各分析物的子离子（碎片），每个分析物先选择2 个碎片，再从中选取信号较强、又无互相干扰的碎片定性和定量。优化后的MRM 条件及碰撞能和去簇电压见1.2 中表3 所示。

2.4 萃取溶剂、萃取方式及时间的优化

参考已有文献所用提取溶剂，对纯水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯提取口含烟样品中亚硝基氨基酸的效果进行考察。水溶液与甲醇的萃取效率高，且萃取效率相当；乙酸乙酯萃取效率最低。比较了涡旋、超声及振荡三种方式的萃取效果。实验结果表明，涡旋、超声两种萃取方式的萃取效率基本相当，均比振荡方式萃取效率高10%以上。对萃取时间从5 min 到60 min 进行了考察，结果显示，30 min 以后，4 种亚硝基氨基酸萃取量达到平台而不再上升。每次实验平行做3 次，取其均值作图，SD 如图示意，实验结果见图5。

2.5 净化方式的选择

口含烟样品采用去离子水萃取后，萃取液呈深棕色液体，基质复杂；根据亚硝基氨基酸酸为极性小分子的性质，尝试了3 种思路对样品进行净化。①借鉴QuEChERS 方法，考察了Bond Elut C18、Bond Elut Carbon 两种吸附剂的净化效果，结果表明：Bond Elut Carbon 对样本基质有一定的净化作用，但同时对目标化合物有一定的吸附，4 种化合物与对照样品相比，响应大幅下降。②一般氨基酸的净化多采用阳离子交换，其原理是利用了氨基的电负性，但是亚硝基氨基酸结构中亚硝基取代了氨基上的氢原子，降低了电负性，因此在净化时，首先考虑了分子结构中的羧基，选用了Bond Elut SAX 强阴离子交换柱和具有非极性及阴离子交换两用作用的Bond Elut Plexa PAX两种小柱进行固相萃取，结果表明：4 种化合物在两种小柱上均不保留，也达不到净化效果。③固相支撑液液萃取（SLE）以比表面积高、化学惰性好的多孔硅藻土为液液分配载体，充分发挥硅藻土多孔性、大比表面、低表面活性等特点，快速地吸附样品基质中的水分，多孔的硅藻土表面能够形成一层薄薄的液膜，当采用有机溶剂洗脱时，在互不相溶的两相实现快速微观液液萃取。SLE 具有不易产生乳化现象、基质效应降低和需要样品量少等优点，并可实现高通量样品操作，是分析实验室的一种高效样品前处理工具。 SLE 使用相应的萃取柱，仅需上样和洗脱两步，即可从水相中萃取目标化合物。从亚硝基氨基酸的结构来看，由于亚硝基取代了氨基上的氢原子，增加了亚硝基氨基酸的疏水性，其在有机溶剂乙酸乙酯中还是有相当的溶解度的。萃取溶剂优化实验表明，假设水的萃取效率是100%，相同样品量、相同溶剂体积下，乙酸乙酯对四种亚硝基氨基酸的萃取效率是大于50%的。因此，4 种亚硝基氨基酸在乙酸乙酯中均具有相当的溶解度。选取BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱对样品进行净化，用乙酸乙酯（含2%乙酸）洗脱，实验结果表明：30 mL 乙酸乙酯可将目标物完全洗脱，样品浓缩复溶后，进LC-MS-MS 分析，4 种亚硝基氨基酸峰形良好，可达基线分离，且灵敏度较高，完全满足样品测试需要，样本中4 种目标物MRM 谱图如2.2.2 中图4（B）所示。

图5 萃取溶剂(A)及萃取方式(B)的选择Fig.5 Selection of extraction solvent (A) and extraction method (B)

2.6 标准工作曲线、检出限和定量限

N-亚硝基肌氨酸（NSAR）、3-（N-甲基亚硝基氨基）丙酸（MNPA）、4-（N-甲基亚硝基氨基）丁酸（MNBA）和亚硝基氮杂环丁烷-2-羧酸（NAzCA）标准工作溶液浓度范围分别为10～500 ng/mL；50～2500 ng /mL；10～500 ng /mL；10～500 ng /mL。标准工作溶液中内标NAzCA- d5、NSAR- d3、MNBA- d3 浓度均为50.0 ng/mL，MNPA-d3 浓度为250.0 ng/mL。分别对标准工作溶液进行HPLC-MS/MS 分析，并以亚硝基氨基酸化合物与内标物峰面积比对浓度比进行线性回归，得到各目标化合物的标准工作曲线。以不低于3 倍性噪比为检出限，以不低于10 倍性噪比为定量限，结果如表4 所示。

2.7 基质效应考察

分别采用口含型、含化型、胶基型制品提取溶液配制基质匹配校正溶液，比较和溶剂校正曲线斜率的差异性，以评价基质效应。实验结果表明（表5），采用口含型、含化型、胶基型三种基质配制标准曲线方程的斜率与采用溶剂配制标准曲线方程的斜率之比值（SR）均在94.4%～105.6%之间，表明该方法基质效应较小，可采用溶剂配标方式。分析其原因主要是因为前处理方法中采用了BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱，通过液液萃取，及后续的浓缩复溶，净化了样本基质，部分除去了影响离子化的干扰成分， 另外实验时，相应的氘代内标也起到了校正作用。

表4 4 种亚硝基氨基酸的线性方程、相关系数、检出限及定量限Tab.4 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and quantitation of the four N-nitrosamino acids

表5 3 种口含烟的基质效应Tab. 5 Matrix effects of three kinds of oral smokeless tobacco products

2.8 方法精密度与准确度

选取含有4 种亚硝基氨基酸的口含型样品1 种，进行方法日内及日间精密度实验。一天内进行5 平行实验以考察方法日内精密度，连续5 天，每天进行实验以考察方法日间精密度，结果表明，4 种亚硝基氨基酸的日内精密度小6.5%，日间精密度小于9.4%。

在进行方法准确度考察时，考虑到样品基质的差异性，选取口含型、含化型、胶基型口含烟各1种，在高、中、低3 个浓度水平进行加标回收率测定，平行测定3 次，结果如表6 所示。NSAR、NAzCA、MNPA、MNBA 加标回收率范围分别在84.2%～102.3%、77.7%～102.3%、90.8%～111% 和89.5%～101.7 %之间。

2.9 部分口含烟样品中4 种亚硝基氨基酸含量

国内目前还没有口含烟中亚硝基氨基酸含量的报道，国外对口含烟中N-亚硝基氨基酸的文献报道主要集中在1985 年到1999 年，基本采用的是重氮甲烷衍生GC-TEA 检测方法。八十年代，Ohshima H等确认了烟草制品中MNPA 及MNBA 的存在，并对瑞典、美国的鼻烟及比利时嚼烟进行了分析，含量范围分别为0.1～7 µg/g、ND～2.24 µg/g。1988 年，1989年，Tricker AR 等分别对印度zarda、kiwam 口含烟进行了分析NSAR、NAzCA、MNPA 及MNBA 含量范围分别为ND～0.35 µg/g、ND～0.14 µg/g、0.08～7.8 µg/g、0.008～1.1 µg/g。九十年代，Djordjevic MV 等研究了存储条件对烟草亚硝基氨基酸含量的影响，结果表明，随着存储时间的延长及存储温度的升高，亚硝基氨基酸含量呈增加趋势。Hoffmann DH、Djordjevic MV 等对瑞典、美国的口鼻烟中的亚硝基氨基酸含量也进行了研究，NSAR、MNPA、MNBA含 量 范 围 分 别 为ND～0.68 µg/g、1.45～14.03 µg/g、0.01～6.9 µg/g。由此可见，随着原料及加工工艺的不同，亚硝基氨基酸含量差异较大。

表6 4 种亚硝基氨基酸的加标回收率Tab. 6 Spiked recoveries of the four N-nitrosamino acids

表7 14 个口含烟样品中四种亚硝基氨基酸的含量 Tab. 7 Contents of the four N-nitrosamino acids in 14 oral smokeless tobacco product samples ng/g

采用本文所建方法测定了14 种不同类型及口味含烟样品中4 种亚硝基氨基酸含量，结果如表7 所示。测试结果表明： 胶基型和含化型制品中未检出4种亚硝基氨基酸；在其它10 个口含型样品中，部分检出NSAR、NAzCA，均检出了MNPA、MNBA。NSAR、NAzCA、MNPA 及MNBA 检 出 量 分 别 为ND～128.3 ng/g 、ND～141.6 ng/g 、1687.1～2424.1 ng/g、65.0～199.5 ng/g。与以往文献相比，袋装、散装口含烟四种亚硝基氨基酸含量均在以往所报道的范围内，且偏向于含量范围的低端，这主要是因为，许多烟草公司致力于产品加工工艺改进，不断降低有害成分的含量，以至于新产品中有害成分含量显著低于传统类型的无烟气烟草制品（如嚼烟、斗烟、含烟等）[24]。对于新出现的产品类型，如：口含型片剂、胶基型口含烟，由于烟丝用量较少，及加工工艺的改进，四种亚硝基氨基酸均未检出。

3 结论

以水为溶剂，萃取口含烟中NSAR、NAzCA、MNPA、MNBA 四种亚硝基氨基酸，经BIOTAGE isolute SLE 硅藻土液液萃取柱进行净化浓缩，建立了简单、准确的检测口含烟中4 种亚硝基氨基酸的LCMS/MS 分析方法。4 种亚硝基氨基酸工作曲线相关系数均大于0.999，检出限、定量限分别在1.4～5.0 ng/g之间、4.8～18.9 ng/g 之间，回收率均在77.7%～111%之间。用该方法分析国内外14 种市售品牌口含烟，结果表明胶基型和含化型制品中未检出4 种亚硝基氨基酸；口含型样品中，部分检出NSAR、NAzCA，均检出MNPA 及MNBA ； MNPA 含量最高，范围为1687.1～2424.1ng/g。该方法前处理简单，结果准确，易于推广应用。